Материал: Полимеразная цепная реакция
амплифицировать РНК. Данная проблема решается путем проведения обратной транскрипции: синтеза на матрице РНК комплементарной ей ДНК (кДНК). Для проведения данной реакции используют фермент ретровирусного происхождения: обратную транскриптазу, катализирующий синтез ДНК на матрице РНК.
При проведении обратной транскрипции реакционная смесь должна включать следующие компоненты:
1)Исследуемый материал, содержащий РНК выявляемого вируса
2)Фермент обратная транскриптаза ретровирусного происхождения (обычно вируса лейкоза мышей или миелобластоза птиц).
3)Смесь нуклеотидов
4)Праймеры («рэндом»-праймеры).
Достройка комплементарной цепи ДНК с участием обратной транскриптазы (как и в случае с «обычной» ДНК-полимеразой) требует наличия затравочного праймера. В качестве праймеров, являющихся затравкой для обратной транскриптазы, обычно используются т.н. «рэндом» (случайные)-праймеры. Рэндом-праймеры представляют собой смесь из коротких праймеров длиной 6 нуклеотидных остатков. Нуклеотидная последовательность в рэндом-праймерах является случайной, и в смеси присутствуют все возможные варианты последовательности из 6 нуклеотидов. Такая длина праймера является минимально достаточной для того, чтобы он мог использоваться обратной транскриптазой в качестве затравки для синтеза комплементарной цепи.
Обратная транскрипция обычно проводится при стабильной температуре 37ºС (температурный оптимум для обратной транскриптазы). Рэндом-праймеры связываются с молекулами РНК в реакционной смеси, после чего обратная транскриптаза достраивает комплементарные цепочки ДНК. Рэндом-праймеры могут связываться с любыми содержащимися в реакционной смеси молекулами РНК в любой точке, поэтому обратной транскрипции подвергаются все содержащиеся в реакционной смеси молекулы РНК, причем продуктом реакции могут являться как полноразмерные, так и, гораздо чаще, «укороченные» комплементарные им ДНК.
Таким образом, обратная транскрипция с использованием рэндомпраймеров не является специфической, так как обратной транскрипции подвергается вся РНК в реакционной смеси (а не только РНК выявляемого вируса) и, следовательно, подавляющее большинство полученной таким образом кДНК будет балластной (рис.9).
3’ |
3’ |
3’ |
|
|
|
|
|
-рэндом праймер |
|
|
|
|
|
|
ОТ |
|
… |
|
|
|
|
|
|
5’ |
5’ |
5’ |
|
|
|
РНК |
РНК |
РНК |
кДНК |
кДНК |
смесь кДНК |
Рис. 9. Схема реакции обратной транскрипции: присоединение к цепи РНК рэндом-праймера в случайной позиции; достройка комплементарной цепи ДНК с участием обратной транскриптазы (ОТ). Так как точка присоединения рэндом праймера является случайной, в реакции образуются нити ДНК разной длины: от полноразмерных копий до очень коротких фрагментов.
Нередко вместо рэндом-праймеров используют олиготимидиновый праймер из 15-18 нуклеотидов, содержащих тимин. Информационные РНК в клетке на 3’- конце имеют т.н. полиаденильный хвост – последовательность из 15-200 аденинсодержащих нуклеотидов. Аналогичная структура есть в составе РНК большинства вирусов. Олиготимидиновый праймер связывается с полиаденильным хвостом и выполняет роль затравки для обратной транскрипции.
Использование олиготимидинового праймера вместо рэндом-праймера имеет следующие преимущества:
1)Обратной транскрипции не подвергаются клеточные рибосомные и транспортные РНК (которые не имеют полиаденильного хвоста и которые составляют около 99% клеточной РНК). Это позволяет избавиться от значительной части балластной РНК.
2)Образующая кДНК является полноразмерной, так как олиготимидиновый праймер связывается с 3'-концом матричной РНК. При использовании рэндом-праймеров подавляющее большинство полученной кДНК является укороченной со стороны 5'-конца.
Вто же время, не все РНК-содержащие вирусы содержат полиаденильный хвост. Для выявления РНК этих вирусов олиготимидиновый праймер непригоден.
Необходимо отметить, что полученная в результате обратной транскрипции кДНК не идентична матричной РНК, а комплементарна ей. Если исходная РНК была представлена «плюс»-цепью, то продуктом обратной транскрипции будет «минус»-цепь кДНК.
Вбольшинстве случаев выделенную РНК сначала подвергают обратной
транскрипции, после чего полученную смесь, содержащую кДНК, используют для
постановки ПЦР. Нередко в коммерческих тест-системах для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний обратную транскрипцию и ПЦР проводят «в одном флаконе», добавляя в реакционную смесь одновременно компоненты для обеих реакций. В этом случае сначала проводится обратная транскрипция при стабильной температуре (37°С) в течение приблизительно 30 мин., после чего запускаются стандартные температурные циклы ПЦР. Такой вариант более удобен, но отличается меньшей чувствительностью, чем раздельная постановка реакций.
ПЦР «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ» («real-time»-PCR)
При проведении ПЦР с электрофоретической детекцией выявление накопленных в ходе реакции ампликонов осуществляется уже после завершения реакции. Однако в начале 1990-х исследователи предложили методику регистрации накопления ДНК непосредственно в ходе ПЦР. Первоначально данная методика предназначалось для оценки количества молекул ДНК в реакционной смеси. Технология ПЦР «в реальном времени» получила быстрое развитие, к середине 1990-х появились первые специализированные амплификаторы для данного типа реакции. В настоящее время ПЦР «в реальном времени» практически вытеснила ПЦР с электрофоретической детекцией из лабораторной практики. Связано это с тем, что ПЦР «в реальном времени» имеет ряд преимуществ перед ПЦР с электрофоретической детекцией:
1)ПЦР «в реальном времени» позволяет отслеживать накопление ампликонов непрерывно в течение реакции, что позволяет оценивать эффективность ее протекания. При использовании ПЦР с электрофоретической детекцией результат реакции можно зарегистрировать лишь после ее завершения.
2)Отсутствие этапа электрофоретической детекции. После завершения ПЦР в реакционной смеси содержатся десятки миллионов ампликонов. Электрофорез продуктов ПЦР приводит к распылению ампликонов и создает опасность загрязнения ими исследуемого материала, что приводит к ложноположительным результатам. По этой причине для электрофореза выделяют отдельное помещение, которое стараются отделить от прочих помещений для ПЦР. При использовании ПЦР «в реальном времени» риск загрязнения исследуемого материала ампликонами минимален.
3)Возможность оценки количества молекул НК выявляемого микроорганизма, содержащихся в исследуемом материале (количественная ПЦР).
4)Возможность проведения мультиплексной ПЦР, т.е. выявления нуклеиновой кислоты сразу нескольких возбудителей в одной реакции.
Особенностью ПЦР «в реальном времени» является использование флуоресцирующих красителей (флуорофоров).
Флуорофоры – это вещества, которые способны поглощать свет одной длины волны (обычно это УФ) и испускать свет с другой, большей длиной волны. Излишек энергии при этом рассеивается в виде тепла.
Для проведения ПЦР «в реальном времени» используют специальные детектирующие амплификаторы, которые представляют собой обычные амплификаторы, на которые установлена детектирующая камера, регистрирующая излучение флуорофоров.
Рис. 10. Амплификатор для ПЦР «в реальном времени» (сверху установлена детектирующая камера).
Общий принцип работы детектирующего амплификатора выглядит следующим образом. В детектирующей камере есть галогеновая лампа, которая является источником ультрафиолета. Свет этой лампы падает на пробирку, и флуорофор в реакционной смеси начинает излучать свет другой длины волны, который падает на светочувствительную матрицу, фиксирующую интенсивность излучения. Между матрицей и пробиркой находится светофильтр, который пропускает лишь излучение от флуоресцирующего красителя и «отсекает» излучение с другой длиной волны (рис. 11).
При проведении ПЦР «в реальном времени» в амплификатор вставляются пробирки с реакционной смесью, и далее запускается обычный цикл амплификации. Периодически, обычно на стадии отжига, включается детектирующая камера и оценивает уровень флуоресценции. Таким образом, учет результата ПЦР производится непосредственно в ходе реакции, на каждом цикле амплификации.
Управление детектирующим амплификатором, сбор, анализ и обработка поступающей с прибора информации осуществляется в автоматическом режиме с помощью компьютера.
hv
hv |
hv |
галогеновая |
реакционная |
|
|
|
лампа |
смесь для ПЦР с |
светофильтр |
свето- |
|
(УФ излучатель) |
флуорфорами |
|||
|
чувствительная |
|||
|
|
|
||
|
|
|
матрица |
Рис. 11. Общая схема работы амплификатора с детектирующей камерой (пояснение в тексте).
Выделяют две основные разновидности ПЦР «в реальном времени»:
1)Реакция с использованием интеркалирующих флуоресцирующих красителей
2)Реакция с использованием меченных флуорофорами проб.
ПЦР «в реальном времени» с использованием интеркалирующих флуоресцирующих красителей
Интеркалирующими называют флуорофоры, которые способны к флуоресценции, будучи включенными в состав двухцепочечной молекулы ДНК. Таким красителем является бромид этидия, используемый для окрашивания ампликонов после электрофореза, однако он подавляет амплификацию. Поэтому в ПЦР «в реальном времени» вместо него используются другие красители, самыми распространенными из которых являются SYBR Gold и SYBR Green. При добавлении этих красителей в смесь для ПЦР по мере накопления ампликонов возрастает интенсивность флуоресценции. В ходе реакции детектирующая камера амплификатора постоянно отслеживает уровень флуоресценции в реакционной смеси. Полученная информация передается на компьютер, который постепенно выстраивает кривую изменения флуоресценции (рисунок). На оси абсцисс графика отложены номера циклов амплификации, на оси ординат – интенсивность флуоресценции. В первых циклах реакции (нижнее плато кривой) количество образующихся ампликонов растет, но оно не достаточно для того, чтобы прибор мог детектировать флуоресценцию. После накопления достаточного числа ампликонов прибор начинает регистрировать флуоресценцию, и ее интенсивность растет в геометрической прогрессии, пропорционально росту числа ампликонов (фаза логарифмического роста). По мере израсходования содержащихся в реакционной смеси праймеров и нуклеотидов, синтез новых ампликонов прекращается, и кривая флуоресценции выходит на верхнее плато. О положительном результате ПЦР свидетельствует превышение порогового уровня