ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет МЗ РФ
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Фадеев Ф.А.
Екатеринбург
2015
ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет МЗ РФ
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
(учебное пособие)
Екатеринбург — 2015
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) при диагностике инфекционных заболеваний (учебное пособие). Екатеринбург: ГБОУ ВПО Уральский
государственный медицинский университет МЗ РФ, 2015, 33 стр.
Учебное пособие посвящено описанию ПЦР как одного из методов диагностики инфекционных заболеваний. В первой части пособия дано строение нуклеиновых кислот, а также описание процессов репликации ДНК, РНК и обратной транскрипции in vivo, так как их механизмы лежат в основе метода ПЦР. Во второй части пособия дано описание метода ПЦР и различных его вариаций (ПЦР с ЭФ детекцией, ПЦР с обратной транскрипцией, ПЦР «в реальном времени» и ПЦР с флуоресцентной детекцией по конечной точке) с подробным рассмотрением механизма всех вариантов реакции.
Пособие предназначено для студентов медицинских вузов.
Составитель:
к.б.н. Фадеев Ф.А.
Рецензент –
ОГЛАВЛЕНИЕ |
|
Введение |
3 |
Строение ДНК и РНК |
5 |
Репликация и транскрипция нуклеиновых кислот в клетке. |
|
Обратная транскрипция |
7 |
Механизм полимеразной цепной реакции |
11 |
ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) |
19 |
ПЦР «в реальном времени» (“real-time” PCR) |
22 |
ПЦР с флуоресцентной детекцией по конечной точке |
32 |
Список литературы |
34 |
Тренировочные тесты |
34 |
Вопросы для самоконтроля усвоения материала |
35 |
Используемые сокращения:
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота НК – нуклеиновая кислота ОТ-ПЦР – ПЦР с обратной транскрипцией
ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота УФ – ультрафиолет
ЭФ детекция – электрофоретическая детекция
ВВЕДЕНИЕ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана в 1983 г. американским ученым Кэрри Мюллисом, получившим за эту разработку Нобелевскую премию. Относительная простота исполнения, высокая чувствительность и специфичность принесли методу популярность. За короткое время ПЦР распространилась по всему миру. В настоящее время ПЦР широко используется как в научных исследованиях, так и при проведении рутинной лабораторной диагностики.
ПЦР очень широко применяется при диагностике инфекционных заболеваний. Метод позволяет выявить в исследуемом материале возбудителей, в том числе некультивируемых, которых невозможно выделить бактериологическим методом, провести генотипирование микроорганизмов, оценку их вирулентности, определить устойчивость к антибиотикам, провести биологический контроль препаратов крови и т.д.
Применение ПЦР не ограничивается инфекционными заболеваниями. Метод также используется при диагностике опухолей, наследственных заболеваний, для пренатальной диагностики, при оценке генетической предрасположенности человека к заболеваниям, для установления отцовства и в иных видах исследований.
ПЦР относится к группе молекулярно-генетических методов исследования и лабораторной диагностики. В настоящее время разработаны десятки модификаций метода, однако общий его принцип во всех случаях остается одинаковым. Основой метода ПЦР является процесс амплификации, т.е. многократного копирования определенного участка ДНК в условиях in vitro. При диагностике инфекционных заболеваний амплификации подвергается участок нуклеиновой кислоты возбудителя, при диагностике неинфекционных заболеваний – интересующий участок ДНК пациента. Продуктами ПЦР являются ампликоны, т.е. копии участка ДНК, подвергшегося амплификации. Количество исходных молекул ДНК может быть очень небольшим (могут быть даже единичные молекулы), тогда как количество ампликонов, синтезированных в ходе ПЦР, обычно исчисляется десятками миллионов.
Чаще всего ПЦР применяется для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. В исследуемом материале выявляется нуклеиновая кислота возбудителя путем амплификации определенного участка его ДНК и последующего выявления полученных ампликонов.
Преимуществами ПЦР при диагностике инфекционных заболеваний являются:
1)Высокая чувствительность (для выявления возбудителя в исследуемом материале достаточно 1 молекулы его ДНК), которую сравнивают с возможностью найти иголку в стоге сена.