Автореферат: Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

Таким образом, сайты XbaI расположены за пределами структурной части генов и консервативны для всех линий D. virilis. Гибридизация в области фрагмента длиной 4 т.п.о. у разных линий D. virilis имеет разную интенсивность, что позволяет предположить наличие разного числа копий данных фрагментов и, соответственно, входящих в их состав генов бтш70 у разных линий. Внутривидовые различия в числе копий бтш70 ранее не были описаны в литературе.

Рис. 23 Саузерн-анализ геномной ДНК из разных линий D. virilis и D. lummei. Гибридизация с PCR-фрагментом гена бтш70 D. lummei 200. 1 - D. lummei 200; 2 - D. lummei 202; 3 - D. lummei 1102; 4 - D. virlis 160; 5 - D. virlis 1433; 6 - D. virilis T-53; 7 - D. virilis 9; 8 - D. virilis T-40

4.12. Определение числа копий гена бтш70 у разных линий D. virilis и D. lummei. Для проверки гипотезы о наличии разного количества копий гена бтш70 у разных линий внутри вида Drosophila virilis было проведено измерение интенсивности гибридизации радиоактивно меченого зонда из гена бтш70 D. lummei с фрагментами, получаемыми при обработке геномной ДНК разными ферментами рестрикции (метод определения числа копий гена по Саузерну). Рестрикция для анализа проводилась ферментами XbaI, XbaI/AccI и XbaI/HindIII.

Интенсивность гибридизации линейно зависит от содержания ДНК в геле. В качестве внутреннего стандарта для рестрикции XbaI использовались уникальные фрагменты длиной 10 и 3 т.п.о., содержащие по одной копии гена, а в случае рестрикции по XbaI/AccI - фрагменты длиной 5 и 3 т.п.о. Число копий гена бтш70 у различных линий D. virilis приводится в таблице 2. Расчеты проводились на основе обсчета четырех независимых экспериментов, с достаточно высокой точностью (относительная ошибка не превышает 10%). Внутривидовые различия в числе копий бтш70 у природных линий Drosophila обнаруживаются впервые.

Как уже говорилось выше, наибольший интерес в данной работе представляет сравнение числа копий и структуры генов бтш70 D. virilis и D. lummei. Будучи северным видом с низкой термальной адаптацией, D. lummei резко отличается от D. virilis по количеству и динамике синтеза мРНК и белка БТШ70 (см. выше).

При рестрикции XbaI у всех линий D. lummei образуются четыре фрагмента длиной 2,8; 3,2; 4,5 и 10 т.п.о. (рис. 23). У 200-й линии все четыре фрагмента с одинаковой интенсивностью гибридизуются с 5'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster, у остальных линий фрагмент длиной 4,5 т.п.о. гибридизуется более интенсивно.

Таблица 2 Число копий гена бтш70 у разных линий D. virilis и D. lummei. * - одна из копий функционально неактивна

При рестрикции XbaI/AccI из XbaI-фрагмента длиной 2,8 т.п.о. вырезается участок длиной ~ 1,6 т.п.о. Оба эти фрагмента не гибридизуются с зондом к 3'-кодирующей части гена бтш70 D. melanogaster., По всей видимости, данная копия бтш70, утратила 3'-кодирующую часть гена и представляет собой функционально неактивный псевдоген. Таким образом, анализ геномной ДНК по Саузерну выявляет значительные отличия в структуре кластера генов бтш70 D. lummei по сравнению с D. virilis.

4.13. In situ-гибридизация с политенными хромосомами D. virilis и D. lummei. В работе М.Б. Евгеньева с соавторами (Evgen'ev M.B., et al., 1978) было показано, что мРНК, выделенная из клеток D. virilis после ТШ, меченная радиоактивным йодом, гибридизуется с двумя единичными локусами политенных хромосом - 29С и 20F. Нами было показано, что гены бтш70 расположены в локусе 29С. Для наглядной иллюстрации различия числа копий генов у D. virilis и D. lummei была поставлена in situ-гибридизация с политенными хромосомами гибридов F1 D. virilis 160 х D. lummei 200. Гибридизация была поставлена с меченой пробой D. lummei 200, содержащей бтш70 и прилежащую 3'-фланкирующую последовательность, включающую в себя повтор, специфичный для D. lummei. На рис. 24 видно, что бьльший по размеру пуф D. virilis, содержащий 7 копий генов бтш70, гибридизуется с пробой интенсивнее, чем меньший по размеру пуф D. lummei 200, содержащий 3 копии.

Рис. 24 Анализ генов бтш70 у гибридов D. virilis и D. lummei методом in situ гибридизации на политенных хромосомах

4.14 Определение структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei на основе рекомбинантных фагов л. Исходя из картины in situ-гибридизации, а также из данных, полученных для других видов Drosophila, мы предполагали, что у D. virilis и D. lummei гены бтш70 организованы в виде одного кластера, как, например, у D. auraria. Для проверки этой гипотезы, а также для определения нуклеотидной последовательности генов бтш70 и прилегающих последовательностей были получены геномные библиотеки в фаговом векторе лDASH. Для получения библиотек использовались линия D. virilis 160 и линия D. Lummei 200. Было отобрано пять фагов из библиотеки D. virilis, обозначенных как 1, 2, 3, 7 и 17, и четыре фага из библиотеки D. lummei, обозначенных как 1/1, 17, 39 и 42 (см. рис. 25).

Рис. 25 Структура рекомбинантных фагов л и кластеров генов бтш70 D. virilis 160 и D. lummei 200. Красными стрелками выделены гены бтш70, нефункциональная копия D. lummei отмечена розовой стрелкой. Подробнее см. в тексте

Фрагменты, полученные при расщеплении фаговой ДНК различными рестриктазами и их комбинациями, были переклонированы в плазмиду pBluescript SK-. Были построены рестриктные карты, проанализированы данные по гибридизации фрагментов рестрикции с зондами к различным участкам генов бтш70 и фланкирующих последовательностей, и определены нуклеотидные последовательности ряда фрагментов. На основе этих результатов были сделаны выводы о перекрывании фагов, взаимной ориентации генов бтш70 и расстояниях между ними. В состав рекомбинантных фагов из линии 160 D. virilis входят шесть полных копий генов бтш70 и 3'-фрагмент седьмой копии, ограниченный сайтом Sau3A, образованный при частичной рестрикции ДНК для последующего клонирования в составе вектора лDASH.

Фаги, полученные из линии 200 D. lummei, также имеют в своём составе перекрывающиеся последовательности: было показано перекрывание между фагами 17, 39 и 42. В составе этих фагов были клонированы три полноразмерных копии гена бтш70 D. lummei. Данные по перекрыванию фагов и структуре кластера генов бтш70 D. virilis 160 и D. lummei 200 суммированы на рис. 25.

Было показано, что гены бтш70 линии D. virilis 160 действительно организованы в форме кластера из 7-и копий, что подтверждает данные Саузерн-анализа и гибридизации in situ. Шесть генов расположены в тандемной ориентации на расстоянии 4,8 т.п.о. один от другого (считая границами ТАТА-бокс и сигнал полиаденилирования ААТААА), а седьмая копия имеет обратную ориентацию и расположена на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. от соседней (см. рис. 25). Таким образом, два гена бтш70 у линии D. virilis 160 образуют инвертированный повтор, что характерно для всех изученных на сегодняшний день видов Drosophila.

У 200-й линии D. lummei так же, как и у D. virilis, два гена бтш70 расположены в виде инвертированного повтора на расстоянии ~ 1,5 т.п.о. друг от друга. Третья копия в составе фагов 17 и 42, как и копии, входящие в инвертированный повтор, является полноразмерной. Расстояние до этой копии установить не удалось, так как между фагами 1 и 17 отсутствует перекрывание. Для клонирования усеченной копии бтш70, из обработанной ферментом рестрикции XbaI геномной ДНК D. lummei, была получена плазмидная библиотека, которую скринировали XbaI/BamHI фрагментом гена бтш70а D. lummei. Полученные позитивные клоны секвенировали и обнаружили, что в состав клонированного 2.8 т.п.о. фрагмента входит усеченная копия бтш70с. У данной копии отсутствуют 300 н.п. кодирующей последовательности с 5' конца и 813 н.п. из 3' участка. Для определения локализации псевдогена были подобраны праймеры из 3' участка полученного клона и из 5'-конца фага 17. Методом ПЦР был амплифицирован, клонирован и секвенирован межгенный район бтш70с - d.

Можно сделать вывод, что кластеры генов бтш70 у D. virilis и D. lummei различаются по структуре, что выражается в различном числе копий, бьльших расстояниях между тандемно расположенными генами у D. lummei и разной структуре межгенных участков. Кроме того, одна из копий в составе кластера бтш70 D. lummei, является псевдогеном с делецией 5'- и 3'-участков. С другой стороны, у D. lummei, как и у D. virilis имеются два гена, образующие инвертированный повтор.

4.15. Определение первичной последовательности генов бтш70 и прилежащих участков у D. lummei, D. virilis и D. montana. Для более детального функционально-структурного анализа кластера генов бтш70 была полностью определена нуклеотидная последовательность шести генов из линии D. virilis 160 (бтш70a - c и бтш70e - g), и всех четырёх генов из линии D. lummei 200 (бтш70d), клонированных в плазмиду pBluescript SK-. Из генома D. montana 1071.0 был клонирован и секвенирован ген бтш70, с прилежащими 5`- и 3`-фланкирующими последовательностями.

Результаты сиквенса и трансляции белковых продуктов опубликованы в базе данных GenBank NCBI под номерами AY445083, AY445084, AY445085, AY445086, AY445087, AY445088, AY445089, AY445090, AY445091, AY445092, AY445093, AY665298 и AY665299. Полная нуклеотидная последовательность гена бтш70 D. montana депонирована под номером EU523047.

Шесть полностью секвенированных копий генов бтш70 D. virilis высоко консервативны и содержат всего 5 замен на всём протяжении кодирующей последовательности. Из них три замены приходятся на незначащий третий нуклеотид в мультикодирующих кодонах и две - приводят к замене аминокислотного остатка в последовательности кодируемого белка: замена GGG (глицин) на GTG (валин) и GTA (валин) на GCA (аланин). По сравнению с генами бтш70 D. virilis, ген бтш70d D. lummei содержит 33 нуклеотидных замены в составе кодирующей последовательности, из которых 28 являются незначащими, а 5 приводят к замене аминокислотного остатка, и делецию 9-и пар оснований после 1456-го нуклеотида относительно старта транскрипции.

Интересные результаты дало сравнение области промотора бтш70 D. virilis с промоторами генов бтш70 D. lummei, D. montana и D. melanogaster. Промоторные области генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana имеют по две канонических последовательности HSE, тогда как в составе промотора бтш70 D. melanogaster обнаружены четыре копии HSE.

В области 3'-фланкирующей последовательности генов бтш70 D. virilis и D. lummei наблюдается бьльшая дивергенция, чем между самими генами, выражающаяся в наличии нуклеотидных замен и делеций. Нуклеотидная последовательность генов бтш70 D. virilis , D. lummei и D. montana на 80% гомологична генам бтш70 D. melanogaster, такая же гомология наблюдается и между аминокислотными последовательностями белковых продуктов.

В области 3'-фланкирующей последовательности всех генов бтш70 D. virilis, D. lummei и D. montana обнаружен фрагмент мобильного элемента SGM (Corvelo, 2004). Данный мобильный элемент относится к эволюционно древним повторяющимся последовательностям. Был клонирован XbaI/AccI-фрагмент из фага №7 D. virilis, содержащий данную последовательность, и проведён Саузерн-анализ геномной ДНК D. virilis и D. lummei на содержание последовательностей, гомологичных SGM. Как видно из рис. 26, у D. virilis данные повторы локализованы преимущественно в области генов бтш70. В случае D. lummei повторы амплифицированы и, помимо локуса бтш70, распространены по всему геному. Повторяющиеся последовательности, в том числе мобильные элементы, могут играть важнейшую роль в эволюции, в частности способствовать изменению числа копий генов путём неравного кроссинговера и/или внутрихромосомной рекомбинации.

Для проверки гипотезы о роли ретроэлемента SGM в возможных перестройках кластера генов бтш70 у видов группы virilis был проведён Саузерн-анализ структуры кластера у 10 различных генетических линий вида D. virilis. В ходе исследования в линии А11 была обнаружена вставка размером 3,6 т.п.о. в участок ДНК между генами бтш70a и бтш70b, расположенными в виде инвертированного повтора. Клонирование и последующее секвенирование участка ДНК между генами бтш70a и бтш70b линии А11 D. virilis показало, что в данном участке находится интермедиатный повтор SGM.

Кластер генов бтш70 D. lummei отличается от кластера D. virilis по числу и расположению тандемно ориентированных копий, находящихся на больших расстояниях друг от друга. Таким образом, можно сказать, что в ходе эволюции группы virilis изменялось число тандемно ориентированных копий. Общая схема предполагаемой эволюции кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei приведена на рис. 27.

D. pseudoobscura, один из предковых видов рода Drosophila, имеет единственный локус, содержащий два гена бтш70 в виде инвертированного повтора (B. Bettencourt, unpublished data). Из этого следует, что дополнительные копии бтш70 D. virilis (бтш70c - g) образовались в ходе тандемных дупликаций. В ходе дивергенции видов D. virilis - D. lummei, по-видимому, произошла потеря части тандемно ориентированных копий и увеличение длины межгенных участков между ними. Возможным механизмом участия SGM в увеличении или уменьшении числа копий генов бтш70, а также увеличения расстояния между генами бтш70 у D. lummei, может являться неравный кроссинговер и/или рекомбинация между гомологичными участками одной хромосомы.

Особи D. lummei с уменьшенным числом копий генов бтш70 и пониженной экспрессией БТШ70 не выбраковывались в ходе естественного отбора, так как, будучи обитателями климатических зон с умеренным климатом, не подвергались воздействию высоких температур.

Рис. 27 Эволюция кластера генов у группы virilis

Эта гипотеза подтверждается наличием в 3'-фланкирующей последовательности генов бтш70g D. virilis и бтш70d D. lummei специфичной 24-нуклеотидной последовательности, не встречающейся в составе других генов. Возможно, гены бтш70g D. virilis и бтш70d D. lummei являются гомологами, и в ходе эволюции D. lummei были делетированы копии бтш70c - f D. virilis.

5. Роль мобильных элементов в эволюции генов бтш

Одним из важных вопросов, привлекающих внимание исследователей, является анализ закономерностей эволюции семейства генов бтш70. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при эволюции системы генов бтш70 могли происходить как изменения в числе копий бтш70, так и изменения в структуре самого кластера генов, как это было обнаружено у видов D. virilis и D. lummei. По-видимому, важную роль в этом процессе играет древний мобильный элемент SGM. Мобильные элементы (МЭ), встраиваясь в промоторную область генов, могут частично или полностью инактивировать соответствующие копии (Lerman et al., 2003), что приводит к изменению уровня экспрессии БТШ и терморезистентности организма. Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции (Евгеньев, 1998). Имеются данные, что гены бтш70, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» при транспозиции МЭ, из-за конститутивно деконденсированного состояния хроматина таких районов ДНК (Karpov,1984). Выявление преимущественных мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтш70 позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль МЭ в процессах микроэволюции и адаптации.