4.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов D. virilis и D. lummei. Гибриды были получены путём реципрокных скрещиваний линии D. virilis 9 и линии D. lummei 200. Было интересно сравнить термоустойчивость родительских линий D. virilis и D. lummei с термоустойчивостью межвидовых гибридов для того, чтобы определить, существует ли доминирование термоустойчивого, либо термочувствительного фенотипа.
Рис. 15 Базовая и индуцированная термоустойчивость гибридов D. virilis и D. lummei. (pt 36,0єC - предварительный ТШ 36С)
Гибриды в обоих направлениях показывали приблизительно одинаковую базальную термоустойчивость. В отличие от D. lummei, гибриды проявляют достоверную индуцированную термоустойчивость при действии предварительного ТШ в обоих направлениях скрещивания (рис. 15).
4.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei. Важнейшим показателем степени воздействия теплового шока на организм является уровень синтеза белка в клетках. Для определения воздействия ТШ на общий белковый синтез были поставлены эксперименты по определению включения 35S-L-метионина в общий пул синтезируемых белков в клетках слюнных желёз личинок третьего возраста. В эксперименте использовали линию D. virilis 9 и линию D. lummei 200. Полученные результаты суммированы на рис. 16. Видно, что интенсивность включения метки в белки через 1 ч после ТШ 37,5°С не отличается от контрольного значения (25°С), т. е., происходит интенсивное включение метки в БТШ. После восстановительного периода продолжительностью 3 ч, уровень включения метки в белки выше у D. lummei, чем у D. virilis. Это связано с тем, что, синтез БТШ у D. lummei протекает более интенсивно и в течение более длительного времени, чем у D. virilis. Кроме того, в клетках D. lummei после возвращения к нормальным условиям уровень синтеза клеточных белков для восстановления их пула в цитоплазме, вероятно, выше, чем у D. virilis. Это можно объяснить тем, что тепловой шок 37,5°С оказывает более выраженное повреждающее воздействие на D. lummei, чем на D. virilis. При температурах близких к критическим, после восстановительного периода продолжительностью 1 ч, достоверной разницы в количестве включившейся метки между D. lummei и D. virilis не наблюдается. Очевидно, у обоих видов, при температурах выше 40°С, синтез белка блокируется практически полностью. Совершенно иная картина наблюдается через 3 ч после ТШ.
Рис. 16 Интенсивность включения 35S-L-метионина в общий пул клеточных белков при ТШ разной интенсивности. По оси абсцисс - температура ТШ и время восстановления. По оси ординат - имп/мин
Интенсивность включения метки у D. virilis превышает интенсивность включения у D. lummei в 2 раза после ТШ 40,0°С и в 3 раза - после ТШ 40,5 и 41,0°С. Это свидетельствует о восстановлении функций аппарата трансляции у D. virilis и глубоких нарушениях в механизме синтеза белка у D. lummei. При ТШ 41,0°С интенсивность включения метки в белки у D. lummei падает практически до нуля, что коррелирует с данными по выживаемости.
4.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке.
Исходя из имеющихся литературных данных (Ulmasov, 1992; Gehring and Winner, 1995), мы предполагали, что у терморезистентных видов Drosophila будет обнаружена корреляция между повышенной термоустойчивостью и уровнем накопления БТШ70.
Для проверки этой гипотезы мы провели иммуноблоттинг белков, выделенных из мух исследуемых видов и линий, с использованием моноклональных антител 7FB к индуцибельному БТШ70 и антител 7.10.3, реагирующих со всеми членами семейства БТШ70 (рис. 17).
Мух подвергали ТШ продолжительностью 30 мин, с последующим восстановительным периодом продолжительностью 1 и 3 ч, затем получали белковые экстракты для иммуноблоттинга.
Выяснилось, что положительная корреляция между содержанием БТШ70 и терморезистентностью наблюдается в пределах филады D. virilis. Уровень накопления БТШ70 у D. virilis (линии 9, 101, 160) значительно превышает уровень накопления БТШ70 при соответствующих температурах у D. lummei (линия 200). У D. novamexicana (линия 424)
Рис. 17 Количественный анализ накопления индуцибельной формы БТШ70 у имаго разных видов и линий Drosophila в зависимости от ТШ. Значения даны относительно концентрации БТШ70 в линии Oregon R при 37,5°С после 1 ч восстановления
уровень накопления БТШ70 в два раза выше, чем у D. texana (линия 423) при 37,5С. Линия D. lummei 200, с северным ареалом распространения, характеризуется более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с более южными линиями 202 и 207. Особенно заметной разница в накоплении БТШ70 между парами контрастных по термоустойчивости видов становится при температурах, близких к критическим (40 - 41С). При ТШ выше 40С экспрессия БТШ70 практически полностью прекращается у D. lummei и D. texana, но сохраняется на достаточно высоком уровне у D. virilis и D. novamexicana. Эти показатели хорошо соотносятся с данными по термоустойчивости и включению радиоактивной метки в общий пул синтезируемых белков (рис. 16).
Однако, у термоустойчивой линии ТТ D. melanogaster уровень накопления БТШ70 после ТШ интенсивностью 37,5С почти в 2 раза ниже, чем у стандартной линии OR (рис.17). У D. mojavensis, наиболее термоустойчивого вида Drosophila, накопление БТШ70 значительно ниже, чем у OR, даже при максимальном уровне индукции (Krebs, 1999). По нашим данным, все линии D. virilis и изучаемая линия D. novamexicana также характеризуются более низким уровнем накопления БТШ70, по сравнению с OR (см. рис. 17), которая является наиболее термочувствительной из всех изученных линий (критическая температура выживаемости - 40,0С). Таким образом, во многих случаях наблюдается отрицательная корреляция между содержанием БТШ70 при умеренных тепловых шоках (37 - 38С) и термоустойчивостью вида или линии. Однако, при более высоких температурах все линии термоадаптированных видов накапливают БТШ70 в количествах, многократно превышающих накопление у термочувствительных видов. Кроме того, максимум индукции БТШ70 у D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis сдвинут в сторону более высоких температур по сравнению с D. lummei, D. texana и OR (см. рис. 17). Таким образом, можно сделать вывод о преимущественной защитной роли БТШ70 именно при высоких температурах.
4.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ70. Представляло интерес сопоставить данные по накоплению БТШ70 и кинетике синтеза мРНК бтш70. Сравнивали линию D. lummei 200 и линии D. virilis 9 и 160 (см. рис. 18). Видно, что у D. lummei полностью прекращается синтез мРНК бтш70 при 40,0 и 41,0С. Восстановление транскрипции происходит через час после ТШ 40,0С. Накопление белка при этом крайне незначительно даже после 3-х часов восстановительного периода (см. выше). У D. virilis 9 синтез мРНК бтш70 сохраняется как при 40,0, так и при 41,0С. Таким образом, через 1 ч после ТШ 40,0С у линии D. lummei 200 наблюдается уровень транскрипции, сравнимый с линиями D. virilis 9 и 160, тогда как накопления белка, судя по данным Вестерн-анализа, не происходит.
Рис. 18 Уровень индукции мРНК бтш70 при различных значениях ТШ. 1 - 25°С, 2 - 31,5°С, 3 - 37,5°С, 4 - 40,0°С, 5 - 41,0°С, 6 - 40,0°С, 1 ч восстановления. Внизу - гибридизация с зондом к гену актина D. melanogaster
Следовательно, отсутствие синтеза БТШ70 у D. lummei при сублетальных температурах можно объяснить подавлением или нарушением трансляции мРНК бтш70. Аналогичную картину (транскрипцию РНК без последующего синтеза белка у OR) мы наблюдали при сравнении ответа на ТШ 39°С линий D. melanogaster OR и ТТ.
4.7. Исследование ДНК-связывающей активности HSF. Методом связывания и торможения фрагмента ДНК в геле определяли температуру тримеризации HSF. У D. lummei 200 комплекс HSF-HSE образуется при 31С, а у D. virilis 160 - при 32С. Это отличие свидетельствует о более низком пороге индукции генов бтш у северного вида D. lummei, по сравнению с более южным видом D. virilis. При температурах 37,5 - 40,0С существенных отличий в связывании HSF с HSE не наблюдается. Следует отметить тот факт, что при ТШ 40 и 41С у D. lummei связывание HSF с ДНК имеет место, а транскрипции генов бтш70 не происходит. По-видимому, при столь высокой температуре ДНК-связывающая активность HSF сохраняется, но происходит нарушение функций других компонентов аппарата транскрипции. Транскрипционная активность генов бтш70 восстанавливается только через 1 ч после ТШ 40С (см. выше). Сходный характер связывания HSF с HSE у сравниваемых видов при высоких температурах позволяет предположить, что разница в накоплении белкового продукта у исследуемых видов объясняется не особенностями активации HSF, а, скорее всего, разницей в числе генов бтш70.
4.8. Анализ спектра изоформ БТШ70. Представляло интерес сравнить паттерн индукции БТШ70 у D. lummei и D. virilis. Для этого белки разделяли методом двумерного электрофореза и детектировали методом окрашивания азотнокислым серебром, радиоавтографией радиоактивного метионина, либо с помощью иммуноблоттинга. Характер синтеза БТШ у видов группы virilis изучался Sinibaldi и Storti (Sinibaldi and Storti, 1982).
Рис. 19 Схема паттерна и серологические свойства БТШ70 разных видов Drosophila. Указаны значения градиента рН и молекулярные массы в кДа
Нами был проведён анализ с более высоким разрешением зоны 70 кДа и изучен характер экспрессии БТШ при различных температурах. Паттерн БТШ70 разных линий и видов внутри группы D. virilis имеет сходные характеристики, сильно отличаясь от паттерна у D. melanogaster и D. mojavensis (рис. 19). У всех исследованных видов и линий группы D. virilis индуцибельные БТШ70 делятся на две группы, отличающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке, причём каждая группа может включать несколько изоформ. Молекулярные массы белков, входящих в каждую группу, были ориентировочно определены методом электрофореза по маркеру как 70 и 72 кДа.
Практически каждая исследованная линия D. virilis и D. lummei имеет индивидуальный паттерн БТШ70. Интересно, что у всех видов группы D. virilis только группа БТШ70 с молекулярной массой 70 кДа узнаётся антителами 7FB. Белки с молекулярной массой 72 кДа реагируют только с антителами 7.10.3, то есть их серологические свойства напоминают свойства БТШ68 D. melanogaster. Паттерн конститутивных БТШ70, реагирующих с антителами 7.10.3, не отличается у всех рассматриваемых видов, что, очевидно, говорит об их более высокой эволюционной консервативности. Чтобы классифицировать две группы БТШ70 видов филады D. virilis, был предпринят пептидный анализ белков, относящихся к обеим группам. Подтвердилось, что белок с массой 70 кДа и изоэлектрической точкой ~ 6,1 у видов филады D. virilis является гомологом БТШ70 D. melanogaster, а белок с массой 72 кДа и изоэлектрической точкой ~ 5,75 гомологичен БТШ68.
Результаты секвенирования гена бтш68 выявили удлинение С-концевого домена, что объясняет бьльшую молекулярную массу белка (Velikodvorskaia et. al., 2005).
4.9. Изучение паттерна других групп БТШ, индуцируемых тепловым шоком у видов группы virilis. Кроме БТШ70, была изучена экспрессия других семейств БТШ у видов группы virilis. У всех термоадаптированных разновидностей наблюдается более интенсивное включение L-35S-метионина в низкомолекулярные БТШ и БТШ40.
Это было показано на примере линий 9, 101, 160, 1433, Т53 и Т61 D. virilis, линии 424 D. novamexicana, D. mojavensis и линии ТТ D. melanogaster. У D. lummei (линии 200, 202, 207, 1102 и 1109), D. texana (линия 423) и D. melanogaster (линия OR) включение метки в низкомолекулярные БТШ и БТШ40 происходит со значительно более низкой интенсивностью (рис. 20). При субкритических температурах у них снижается уровень включения метионина в БТШ70. Увеличение уровня экспрессии БТШ40 и низкомолекулярных БТШ у видов, обитающих в жарком климате и подверженных действию более высоких температур, может играть значительную роль в формировании термальной адаптации (см. ниже).
Все точки - 40,5С, 3 ч восстановления. Числами указаны молекулярные массы белков в кДа, 70с - конститутивные формы БТШ70.
4.10. Вклад нмБТШ в термоустойчивость. Из ряда работ известно, что большой вклад в термоустойчивость вносит семейство низкомолекулярных БТШ (Tanguay, 2006). Результаты двумерного электрофореза, показывают, что у более термоустойчивых видов: - D. virilis и D. novamexicana включение 35S-L-метионина в группу низкомолекулярных белков 22 - 27 кDa и 40 кDa значительно выше, чем у линий D. lummei и D. texana.
Аналогичная картина характерна для линий D. melanogaster OR и ТТ, а именно, у линии ТТ наблюдается более значительное включение 35S-L-метионина в группу с мол. массой 40 кD и 22 - 27 кD. Нами был подробно изучен синтез нмБТШ у видов Drosophila с разным уровнем термальной адаптации - D. virilis, D. lummei, и D. melanogaster OR. Количественное определение содержания нмБТШ, у всех трёх видов методом Вестерн-блоттинга с антителами, реагирующими с нмБТШ, с последующей денситометрией автографов, выявило более высокое содержание нмБТШ у D. virilis по сравнению с D. lummei и D. melanogaster как при контрольной температуре (25єС), так и при ТШ различной интенсивности (рис. 21).
Рис. 2 Результаты исследований нмБТШ у разных видов Drosophila
Содержание нмБТШ у D. melanogaster OR, D. lummei 200 и D. virilis 9 в зависимости от значений ТШ и времени восстановления. Значения даны относительно концентрации нмБТШ у OR при 37.5ОС и 1 ч восстановления.
Спектр изоформ нмБТШ у D. melanogaster OR значительно отличается от сходных друг с другом спектров изоформ нмБТШ у линий D. virilis и D. lummei (рис. 22.) При этом следует отметить большее число изоформ у термоустойчивого вида D. virilis, чем у D. lummei и D.
4.11. Анализ структуры кластера генов бтш70 D. virilis и D. lummei. Исходя из имеющихся литературных данных о важной роли БТШ70 в термальной адаптации у разных организмов, представляло интерес определить структуру кластера генов бтш70 у используемых в работе видов и линий, контрастных по термоустойчивости. Интересно также выяснить, обусловливается ли повышенный синтез БТШ70 при ТШ у некоторых линий D. virilis увеличением числа копий гена бтш70 или изменениями в их структуре. Для выяснения этих вопросов был проведён Саузерн-анализ геномной ДНК разных линий D. virilis и D. lummei с использованием различных зондов к кодирующей части генов бтш70. Для анализа использовались ферменты рестрикции, сайты которых находятся преимущественно вне кодирующей последовательности генов. При обработке ДНК всех линий D. virilis рестриктазой XbaI образуются три фрагмента ДНК длиной 3, 4 и 10 т.п.о., гибридизующиеся как с 5'-, так и с 3'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster, меченными 32Р (рис. 23).