Результаты исследований и их обсуждение
1. Изучение молекулярных механизмов адаптации у холоднокровных животных из контрастных по температуре экологических ниш
1.1. Экспрессия БТШ70 и HSF у ящериц. Для изучения роли БТШ в адаптации целого организма к определенным условиям обитания, в качестве объекта исследования мы использовали разные виды ящериц, населяющих пустыни Средней Азии. Для сравнения с ними мы выбрали вид из средней полосы, живущий в условиях холодного и умеренного климата (живородящая ящерица - Lacerta vivipara). Среди пустынных видов для подробных исследований выбрали ящериц, активных в дневное время суток (песчаная круглоголовка -Phrynocephalus interscapularis) и в ночное (каспийский геккон - Caspian gecko).
Проведенное нами сравнение уровня синтеза БТШ70 у видов ящериц трех указанных выше категорий показало, что активные днем пустынные ящерицы характеризуются заметным уровнем БТШ70 в клетках и при нормальной температуре, у ночных уровень БТШ70 при нормальной температуре значительно ниже, а у видов ящериц средней полосы БТШ70 в клетках в норме почти полностью отсутствует (рис. 1).
Рис. 1 Иммуноблот-анализ уровня БТШ70 для круглоголовки (1), живородящей ящерицы (2), каспийского геккона (3) в нормальных условиях (25С)
Интересно было выяснить, колеблется ли уровень синтеза БТШ70 у одного из самых термофильных на земле животных, песчаной круглоголовки, в норме в течение дня, в связи с естественными колебаниями температуры воздуха, почвы и тела животного. Мы показали, что тепловой шок у ящериц вызывает активный синтез двух изоформ БТШ70: БТШ68(-) и БТШ68(+). Одна изоформа, БТШ68(+), синтезируется преимущественно при ТШ, а другая, БТШ68(-), при нормальных условиях, при умеренном ТШ, а также при критических для жизни температурах, когда синтез всех других белков подавлен (Ulmasov et al., 1999).
Для выявления возможных колебаний в синтезе БТШ70 в зависимости от изменения температуры тела ящериц, в течение дня in vivo вводили 35S-L-метионин в тело песчаных круглоголовок, отловленных в различное время светового периода суток. Через час после введения метки из печени выделяли белки. После разделения методом двумерного электрофореза выделенных из печени белков, из геля вырезали зоны, соответствующие БТШ68(-) и БТШ68(+), и определяли уровень включенного 35S-L-метионина. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 2.
Рис. 2 Динамика колебаний: температуры тела - 1; синтеза БТШ68(+) - 2 и БТШ68(-) - 3 у песчаной круглоголовки в светлый период суток
Из графика видно, что уровень синтеза БТШ70 в клетках этого вида ящериц имеет положительную корреляцию с колебаниями температуры тела животного, достигающей максимума в середине дня, во время дневной жары. Следует отметить, что высокий уровень синтеза БТШ сохраняется даже после снижения температуры тела до 30 - 35°С. (Ульмасов и др., 1997; Ulmasov et al., 1999).
Чтобы выяснить, обеспечивается ли высокий уровень накопления БТШ70 на стадии транскрипции, или же он достигается за счет высокой стабильности самих БТШ70, мы провели анализ экспрессии мРНК бтш70 в норме и после ТШ у живородящей ящерицы и круглоголовки. Проведенный Нозерн-анализ показал примерно одинаковый уровень накопления мРНК бтш70 после ТШ (42°С 1 ч) для обоих видов, при значительно более высоком конститутивном (при 25°С) уровне синтеза мРНК у круглоголовки (рис. 3).
Различия в уровне мРНК бтш70 и БТШ70 в норме могут достигаться с помощью разных молекулярных механизмов. Одним из них, возможно, является изменение числа генов бтш70 в ходе эволюции у южных и северных видов ящериц. Для проверки этой гипотезы был проведен анализ по Саузерну геномной ДНК, выделенной из песчаной круглоголовки и живородящей ящерицы. При обработке геномной ДНК ферментами рестрикции с последующей гибридизацией с меченым зондом (ген бтш70 Xenopus laevis), получена идентичная картина как по паттерну, так и по интенсивности полос гибридизации.
Исходя из полученных результатов, можно предположить сходную организацию генов бтш70 и равное число (вероятно 2 - 3) их копий у сравниваемых видов. То есть, наблюдаемые нами различия в уровне экспрессии БТШ70 у этих видов, скорее всего, обусловлены различиями в системе регуляции синтеза этих белков.
На стадии транскрипции регуляцию осуществляют факторы транскрипции ТШ (HSF - позитивный регулятор и CHBF - негативный). Было интересно выяснить, имеются ли различия в уровне мРНК hsf и соответствующего белка у изучаемых видов ящериц. Нельзя было исключить и вероятность того, что организация и число копий самих генов hsf различно. Для выяснения этого вопроса был проведен Саузерн-анализ с меченой пробой hsf L. vivipara. Паттерн гибридизации ДНК круглоголовки и живородящей ящериц, обработанных ферментами рестрикции, с пробой к гену hsf, совершенно различен. Это свидетельствует в пользу сильной дивергенции этих генов, а также о возможном их количественном различии, в отличие от изученных у этих же видов генов бтш70. Для выяснения имеющихся различий в уровне мРНК hsf и, соответственно, белка у контрастных по термоустойчивости видов ящериц до и после ТШ были проведены Нозерн- и Вестерн-анализы.
Рис. 4 Анализ уровня экспрессии HSF (А и Б). А. Нозерн анализ РНК (1, 2 - контроль, круглоголовка и живородящая ящерица. 3, 4 - ТШ, круглоголовка и живородящая ящерица (см. рис. 3) с меченой пробой первого экзона гена hsf L. vivipara. Б. Иммуноблот-анализ уровня HSF для круглоголовки (1, 2), живородящей ящерицы (3, 4), каспийского геккона (5, 6) при 25 С (1, 3, 5) и после шока в 42 С в течение 1 ч (2, 4, 6)
Из рисунка 4А видно, что у круглоголовки уровень синтеза мРНК hsf значительно ниже, чем у живородящей ящерицы. Для подтверждения результатов Нозерн-гибридизации был проведен сравнительный анализ содержания общего количества HSF методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител к HSF1 человека (рис. 4Б). Для каспийского геккона характерна единственная полоса иммунопреципитации с антителами к HSF в районе 75 кДа, для живородящей ящерицы, кроме сходной по молекулярной массе полосы, обнаружена вторая в 77 кДа. Обе полосы характеризуются большей интенсивностью у живородящей ящерицы в сравнении с полосами у круглоголовки. Таким образом, данные Нозерн- и Вестерн-анализа подтверждают предположение, сделанное на основе Саузерн-анализа о возможности существования различий в количестве и организации генов HSF у данных видов.
Совокупность полученных результатов указывает на возможную взаиморегуляцию различных компонентов системы ТШ у сравниваемых видов. Суммарное содержание HSF позитивно коррелирует с уровнем индукции синтеза БТШ70 при ТШ и негативно - с внутриклеточным уровнем БТШ70 при нормальной температуре. Биологическое значение установленного феномена может состоять в том, что виды южного происхождения, с исходно высоким внутриклеточным содержанием БТШ70, регулярно подвергающиеся ТШ, не испытывают необходимости в резком увеличении количества этих белков при незначительном повышении температуры. При этом спасающую функцию берут на себя конститутивно присутствующие БТШ70. Виды северного происхождения, редко испытывающие в процессе жизнедеятельности резкие колебания температуры, имеют исходно низкий уровень БТШ70, но высокий конститутивный уровень HSF. Высокий уровень HSF в клетках этих видов обеспечивает быструю и интенсивную индукцию БТШ при ТШ. Из рис. 5 видно, что у живородящей ящерицы интенсивность включения метки в БТШ70 при температурах 37 - 42С значительно выше, чем у каспийского геккона. Также видно, что у северного вида индукция БТШ происходит при более низкой температуре, а у южного - при более высоких температурах. Иными словами, у северных видов порог индукции БТШ ниже, а уровень индукции выше, чем у южных.
Известно, что интенсивность транскрипции зависит от эффективности связывания факторов транскрипции с промоторным участком генов БТШ при ТШ, которая определяется сродством факторов транскрипции к элементам теплового шока (HSE). При этом возможна конкуренция между позитивным фактором транскрипции HSF и негативными регуляторами транскрипции (CHBF). Для исследования взаимодействия факторов транскрипции с промотором у контрастных по теплоустойчивости видов ящериц было проведено исследование комплексов белок - ДНК (HSE).
1.2. Исследование комплексов факторов транскрипции с элементами теплового шока. Активация HSF сопровождается его тримеризацией и связыванием с HSE. Анализировали связывание HSF и других факторов транскрипции с HSE, используя метод электрофореза в неденатурирующих условиях. При этом образцы белковых экстрактов различных видов ящериц до и после ТШ инкубировали с меченым 32P HSE-содержащим олигонукдеотидом. Анализ эффективности связывания HSE с факторами транскрипции в суммарных белковых экстрактах ящериц при нормальных условиях и сразу после ТШ (30 мин) представлен на рис.6.
Из рисунка видно, что в условиях опыта существуют три различных комплекса: I - комплекс характерен для южных видов в нормальных условиях; II - комплекс присутствует в
Рис. 6 Анализ связывания факторов транскрипции с HSE
Каспийский геккон (1, 2); круглоголовка (3 - 6); живородящая ящерица (7 - 8); контроль 25°С (1, 3, 7); после ТШ 42°С (4, 8); 45°С (2, 5); 49° С (6). Стрелки указывают расположение HSE-связывающих комплексов (I, II, III).
нормальных условиях у всех видов, при этом его содержание заметно выше у живородящей ящерицы; III - комплекс появляется после ТШ. При ТШ наблюдается уменьшение связывания для комплекса II и его полное исчезновение при критических для жизни ящериц температурах (круглоголовка - 49°С 20 минут). Важно отметить, что у южных видов (особенно ярко это выражено у геккона) в контроле (25°С) наблюдается комплекс III. Присутствие HSF в изучаемых комплексах можно доказать замедлением подвижности рассмотренных выше комплексов после инкубации их с антителами к HSF (рис. 7).
Резкое замедление подвижности комплексов (2 и 4) после инкубации c антителами к HSF ясно показывает, что самый медленный комплекс - III появляется в результате связывания транскрипционного фактора HSF с HSE.
У контрастных по температуре среды обитания ящериц могут различаться пороговая температура индукции БТШ, кинетика накопления БТШ, а также продолжительность их синтеза. Изучая динамику связывания HSF и CHBF с HSE после ТШ, можно установить эти характеристики (рис. 8).
Видно, что температурный порог активации HSF и его связывания с HSE для живородящей ящерицы наступает уже при 34С, а при шоке 42С 15 мин наблюдается более мощное связывание, чем у круглоголовки. Процесс возврата в нормальное состояние у живородящей ящерицы также продолжается значительно дольше, чем у круглоголовки (6 ч против 1 ч).
Рис. 8 Анализ интенсивности связывания факторов транскрипции с HSE при ТШ и в период восстановления. Круглоголовка (1 - 6); живородящая ящерица (7 - 13). Контроль (1 и 7); ТШ 34С 15 мин (2 и 8); ТШ 42С 15 мин (3 и 9); ТШ 42С 30 мин (4); ТШ 42С 60 мин (5 и 10); ТШ 42С 60 мин и восстановление в течение 60 мин (6 и 11); 3 ч (12); и 6 ч (13)
Другой характеристикой эффективности функционирования системы ТШ может быть степень сродства HSF и CHBF к HSE. Были поставлены эксперименты по конкурентному связыванию HSF и CHBF с HSE, которые выявили большее сродство HSF к HSE для пустынных видов в сравнении с обитателем средней полосы (L. viviparа).
Таким образом, в экспериментах по связыванию белковых экстрактов с HSE были обнаружены следующие закономерности.
Повышенная экспрессия БТШ70 у южных видов в норме (геккон и круглоголовка) контролируется на уровне транскрипции и обусловлена, по-видимому, присутствием незначительного количества активной формы фактора транскрипции генов ТШ в нормальных физиологических условиях, что приводит к «подтеканию» транскрипции.
Северные виды характеризуются более низким порогом индукции и значительно более продолжительным временем связывания HSF с HSE после ТШ (6 ч против 1 ч), что обусловливает более длительное время транскрипции бтш после ТШ, и, соответственно, значительное накопление БТШ после ТШ.
Показана бьльшая степень сродства HSF к промоторной части генов бтш у круглоголовки, по сравнению с живородящей ящерицей. Возможно, благодаря этому, южным видам требуется меньшее количество HSF для активации транскрипции.
Для северных видов выявлена более значительная роль негативного фактора в регуляции транскрипции генов ТШ, чем, возможно, обусловлено отсутствие связывания HSF с HSE в нормальных условиях.
Проводимые нами исследования реакции на ТШ и синтеза БТШ у пустынных организмов не ограничились пойкилотермными (холоднокровными) организмами. Следовало выяснить, справедливы ли обнаруженные нами корреляции между синтезом БТШ и термоустойчивостью у теплокровных животных.
2. Синтез БТШ у народов, населяющих пустыни и области с умеренным климатом
На следующем этапе наших исследований мы решили сравнить характер синтеза БТШ у двух этнических групп людей: русских, проживающих в центральных районах России, и туркмен, живущих в Средней Азии. Проведенный сравнительный анализ показал, что фибробласты туркмен после длительного ТШ 42.5°С в течение 6 ч способны в полной мере синтезировать весь набор белков, в то время как фибробласты русских полностью прекращают синтез всех белков после такого воздействия (рис. 9). При сравнении выживаемости фибробластов (способности образовывать клоны) после длительного ТШ,
Рис. 9 Флюорограммы двумерных электрофорезов белков, синтезируемых в фибробластах кожи человека (А - туркмены; Б - русские). Белки метили 14С-аминокислотами (37°С, 1 ч после теплового шока 42,5°С, 6 ч). Стрелками показана индукция БТШ70 (ас - актин)