5.5. Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях. Влияние инсерций EPgy2 на уровень трансляции генов бтш70 в трансгенных линиях было оценено по результатам одномерного и двумерного электрофореза белков.
Количественная оценка накопления индуцибельного БТШ70 после ТШ была получена с помощью иммуноблоттинга с 7FB антителами. Результаты для некоторых трансгенных линий представлены на рис. 34. После ТШ 30 мин при температуре 37ОС в линиях 30IIb и134Ib наблюдается более низкий уровень индукции БТШ70 по сравнению с US-4. После получасового периода восстановления разница в уровне синтеза БТШ70 между линиями становится меньше.
Проведенный анализ показал снижение уровня трансляции бтш70, что согласуется с пониженным уровнем индукции мРНК бтш70 в трансгенных линиях, по сравнению с контрольной. Несмотря на снижение уровня синтеза мРНК и белка БТШ70, вследствие внедрения EPgy2, термоустойчивость трансгенных линий существенно не меняется.
5.6. Определение плодовитости потомства трансгенных линий. Инсерции мобильных элементов по-разному проявляются на уровне целого организма. Известно, что они могут влиять на одно из самых важных свойств всех живых существ - способность давать плодовитое потомство. Поскольку данное свойство является одним из главных факторов действия естественного отбора, представляло интерес оценить последствия внедрения EPgy2 на фертильность трансгенных линий. Эксперимент по оценке плодовитости потомства был проведен на гомозиготных трансгенных линиях (рис. 35).
В эксперимент были отобраны мухи, находящиеся на одной и той же стадии развития, четырех трансгенных линий 30IIb, 111IIa, 134Ib, 369I (c инсерциями EPgy2 соответственно в положения -96 генов бтш70 Aa и Ab; -97 бтш70Аа; -28 бтш70Аа; -144 бтш70Аа) и линии US-4 (контроль). Ставили серии индивидуальных скрещиваний (одна самка х два самца) и исследовали фертильность мух трех-, шести- и девятидневного возраста. Были проведены исследования репродуктивной способности самок в нестрессовых условиях (постоянное развитие при 25єС) и самок, перенесших тепловой шок (в этом случае девственные самки были подвергнуты ТШ при температуре 37єС в течение 30 мин и скрещены с нестрессированными самцами). Подсчет потомства проводился после вылупления всех куколок (рис. 35). Было показано, что у самок с инсерцией EPgy2 в промотор гена бтш70 после ТШ увеличивалось число потомков, а у контрольной линии - снижалось.
Рис. 35 Определение фертильности трансгенных линий. Столбиками обозначено число потомков трансгенных линий от индивидуальных скрещиваний после 4 - 6; 7 - 9; 10 - 12 дней после вылупления. Белые столбики - потомство от нестрессированных самок, темные от самок после ТШ. Для каждой линии было поставлено 12 независимых скрещиваний; проведен подсчет потомства и статистическая обработка
Таким образом, эти линии могут иметь преимущество в размножении в условиях незначительных температурных перепадов. В работе (Lerman et al., 2003) было обнаружено, что природные линии с инсерцией Р-элемента в промоторную область гена бтш70Ва, более плодовиты, чем линии без инсерций. В работе (Walser, 2006) обнаружили преимущественное встраивание Р-элемента в промоторную область именно генов теплового шока на примере 48 естественных популяций. Так как большинство генов бтш мультикопийно, то встраивание Р-элемента в отдельные промоторы генов бтш, и незначительное снижение уровня их экспрессии в условиях отсутствия резких перепадов температур может быть эволюционно выгодным. Дальнейший естественный отбор на термоустойчивость может приводить к появлению линий типа Termotolerance. Таким образом, МЭ, вероятно, играют важную роль в эволюции адаптации организмов к условиям их обитания.
Выводы:
1. Молекулярные механизмы адаптации к условиям обитания значительно различаются у разных организмов и связаны с уровнем БТШ70 в клетках при нормальных условиях и тепловом шоке. Экспрессия БТШ70 у разных видов может определяться:
а) регуляцией транскрипции,
б) числом копий гена бтш70,
в) встраиванием в промоторную область генов бтш70 мобильных элементов.
2. Основным молекулярным механизмом, обеспечивающим термоустойчивость пустынных видов ящериц, является повышенная экспрессия БТШ70 при нормальных условиях. У северных видов при нормальных условиях синтез БТШ70 отсутствует. Уровень БТШ70 у пустынных организмов претерпевает значительные колебания в течение суток, коррелируя с изменениями температуры окружающей среды и тела животного.
3. Повышенная экспрессия БТШ70 у термофильных ящериц контролируется на уровне транскрипции и обусловлена присутствием активной формы HSF, связанной с промотором в нормальных условиях.
4. На примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и России, впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных.
5. На примере видов Drosophila выявлены сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Показана положительная корреляция между уровнем синтеза БТШ70 и термоустойчивостью у различных географических линий и видов Drosophila группы virilis, однако при сравнении видов, принадлежащих к разным группам рода Drosophila, такой корреляции не наблюдается.
6. Показано наличие индивидуального спектра изоформ БТШ70 у всех изученных линий и видов Drosophila. Показано, что у термоустойчивых видов более интенсивно экспрессируются низкомолекулярные БТШ и БТШ40, по сравнению с термочувствительными, при жестком температурном воздействии.
7. Подробно изучена структура и функционирование системы генов ТШ у нескольких видов Drosophila группы virilis:
а) обнаружены различия как в строении самого кластера генов, так и в числе генов бтш70 у видов и линий данной группы. Показано, что линии термофильного южного вида D. virilis имеют больше копий бтш70, чем линии северного филогенетически близкого вида D. lummei, что может иметь адаптивное значение;
б) у всех копий генов бтш70 видов группы virilis в 3'-фланкирующей последовательности обнаружен древний МЭ SGM. На основании этих результатов предложена модель, объясняющая адаптивные изменения числа копий генов бтш70 у видов группы D. virilis.
8. Промоторная область генов бтш70 D. melanogaster имеет особую структуру, которая определяет преимущественное встраивание Р элемента в определенные участки промотора. Показано, что МЭ играют важную роль в функционировании и эволюции генов бтш70 у различных видов рода Drosophila.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Lyashko VN, Vikulova VK, Chernicov VG, Ivanov VI, Ulmasov KA, Zatsepina OG, Evgen'ev MB. Comparison of the heat shock response in ethnically and ecologically different human populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91 (26): 12492 - 5.
2. Ульмасов Х.А., Зацепина О.Г., Рыбцов С.А., Джумагельдыев Б.Т., Евгеньев М.Б. Некоторые аспекты состояния компонентов системы теплового шока у ящериц различных экологических ниш. Известия АН. Серия биологическая. 1997. 2: 133 - 44.
3. Ulmasov KA, Zatsepina OG, Molodtsov VB, Evgen'ev MB. Natural body temperature and kinetics of heat-shock protein synthesis in the toad-headed agamid lizard Phrynocephalus interscapularis. Amphibia-Reptilia. 1999. 20: 1 - 9.
4. Zatsepina OG, Ulmasov KA, Beresten SF, Molodtsov VB, Rybtsov SA, Evgen'ev MB. Thermotolerant desert lizards characteristically differ in terms of heat-shock system regulation. J. Exp. Biol. 2000. 203 (6): 1017 - 25.
5. Zatsepina OG, Velikodvorskaia VV, Molodtsov VB, Garbuz D, Lerman DN, Bettencourt BR, Feder ME and Evgenev MB. A Drosophila melanogaster strain from sub-equatorial Africa has exceptional thermotolerance but decreased Hsp70 expression. The J. Exp. Biol. 2001. 204: 1869 - 81.
6. Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Гарбуз Д. Г, Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Анализ экспрессии белков теплового шока и терморезистентной линии Drosophila melanogaster. Известия Академии наук, Серия биологическая, 2001. 5: 522 - 32.
7. Гарбуз Д. Г., Молодцов В. Б., Великодворская В. В., Зацепина О. Г., Евгеньев М. Б. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода Drosophila. Генетика, 2002. 38 (8): 1097 - 109.
8. Garbuz DG, Zatsepina OG, Feder ME, Evgen'ev MB. Evolution of termotolerance and the heat-shock response: evidence from inter/intra specific comparison and interspecific hybridization in the Drosophila virilis species group. I/ Thermal phenotype. J. Exp. Biol. 2003. 206: 2399 - 408.
9. Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, David Garbuz, Daniel Lerman, Vera Velikodvorskaia and Olga G. Zatsepina. Evolution of Thermotolerance and Heat-Shock Response in the virilis Species Group of Drosophila. Biology International. 2004. 46: 49 - 51.
10. Evgenev MB, Zatsepina OG, Garbuz DG, Lerman DN, Velikodvorskaia VV, Zelentsova ES, Feder ME. Evolution and arrangement of the hsp70 gene cluster in two closely related species of the virilis group of Drosophila. Chromosoma. 2004. 113 (5): 223 - 32.
11. Zatsepina OG, Garbuz DG, Shilova V, Karavanov AA, Tornatore P, Evgen'ev MB. Use of surface-enhanced laser desorption ionization - time-of-flight to identify heat shock protein 70 isoforms in closely related species of the virilis group of Drosophila. Cell Stress and Chaperones. 2005. 10 (1): 12 - 6.
12. Евгеньев М. Б., Гарбуз Д. Г., Зацепина О. Г. Белки теплового шока: функции и роль в адаптации к гипертермии. Онтогенез. 2005. 36 (4): 267 - 75.
13. Шилова В. Ю., Гарбуз Д. Г., Евгеньев М. Б., Зацепина О. Г.. Низкомолекулярные белки теплового шока и адаптация к гипертермии у видов Drosophila. Молекулярная биология. 2006. 40 (2): 271 - 6.
14. Victoria Y. Shilova, David G. Garbuz, Elena N. Myasniankina, Bing Chen, Michael B. Evgen'ev, Martin E. Feder, and Olga G. Zatsepina. Remarkable Site Specificity of Local Transposition into the hsp70 Promoter of Drosophila melanogaster. Genetics. 2006. 173: 809 - 20.
15. M. B. Evgen'ev, D. G. Garbuz, V.Y. Shilova and O. G. Zatsepina. Molecular mechanisms underlying thermal adaptation of xeric animals. J. Biosci. 2007. 32 (3): 489 - 99.
16. Savvateeva-Popova E, Popov A, Grossman A, Nikitina E, Medvedeva A, Peresleni A, Korochkin L, Moe JG, Davidowitz E, Pyatkov K, Myasnyankina E, Zatsepina O, Schostak N, Zelentsova E, Evgen'ev M. Pathogenic chaperone-like RNA induces congophilic aggregates and facilitates neurodegeneration in Drosophila. Cell Stress Chaperones. 2007. 12 (1): 9 - 19.
17. В. Ю. Шилова, Д. Г. Гарбуз, Е. Н. Мяснянкина, М. Б. Евгеньев, Е. С. Зеленцова, О. Г. Зацепина. Качественный и количественный анализ транспозиций генетической конструкции на основе Р элемента в область генов бтш70 Drosophila melanogaster. Генетика, 2007. 43 (12): 1333 - 43.
18. Bing Сhen, V. Yu. Shilova, O. G. Zatsepina, M. B. Evgen'ev, M. E. Feder. Location of P element insertions in the proximal promoter region of Hsp70A is consequential for gene expression and fecundity in Drosophila melanogaster. Cell Stress Chaperones. 2008. 13 (1): 11 - 7.
19. Д.Г. Гарбуз, И.А. Юшенова, М.Б. Евгеньев, О.Г. Зацепина. Сравнительный анализ структуры кластера генов hsp70 у видов Drosophila группы virilis. Молекулярная биология. 2009. 43 (1): 44 - 52.