Автореферат: Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

Очередной задачей данного исследования была попытка ответить на вопрос - действительно ли промоторы генов бтш70 являются «горячими точками» инсерций МЭ, и как такие встраивания влияют на терморезистентность. Для выполнения этой задачи, на модельной системе D. melanogaster, исследовали перемещение конструкции, созданной на основе Р элемента, в гены бтш70.

5.1. Получение инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза. В данной работе была использована модель целенаправленного получения транспозиций конструкции EPgy2 на основе Р элемента в локус генов теплового шока, примененная при изучении малых генов ТШ (Timakov B., 2002), с некоторыми изменениями. Из коллекции центра (Bloomington Drosophila Stock Center) были получены две лабораторные линии D. melanogaster №15616 и №15904 (обозначенные далее как US-4 и US-2), содержащие исходную конструкцию EPgy2 в локусе 87А на расстоянии 8 и 5 т.п.о., соответственно, от старта транскрипции гена бтш70 Ab (рис.28).

Рис. 28 Расположение исходной конструкции EPgy2 в линиях US-4 (в положении +243 относительно старта транскрипции гена CG12213) и US-2 (+33 относительно старта транскриции гена aur) D. melanogaster. Стрелками указано направление транскрипции генов

Также была получена линия №1429 (обозначена далее как Д2-3), несущая ген транспозазы Р элемента.

В результате скрещиваний (Рис. 29) нами были выведены линии с перемещением конструкции. Для линий, полученных из US-4, общая частота перемещения конструкции составляет 7,5%, для линий US-2 - 4,9%. Некоторые инсерции конструкции в гены бтш70 были переведены в гомозиготное состояние.

5.2 Идентификация инсерций EPgy2 методом Саузерн-блот-анализа. Анализ проведенных скрещиваний позволил отобрать линии с дополнительными инсерциями EPgy2 в той же хромосоме, что и стартовый элемент. Для того чтобы определить, произошло ли встраивание EPgy2 в какую-либо из шести копий гена бтш70, был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК трансгенных линий. При обработке геномной ДНК D. melanogaster парой рестриктаз BamHI/HindIII образуется набор фрагментов разной величины, специфичный для разных копий гена бтш70 (рис. 30А, Б, В).

Рис. 30 А. Гибридизация с 5'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster. Стрелками показаны линии, несущие инсерции EPgy2 в разных копиях бтш70 (Аа и Аb). Справа указан молекулярный вес фрагментов гибридизации, специфичных для разных копий бтш70. Б. Гибридизация с 3'-фрагментом гена бтш70 D. melanogaster. В. Схема сайтов рестрикции BamHI/HindIII генов бтш70, расположенных в локусе 87А (бтш70 Aa , Ab) и 87С (бтш70 Ba, Bbb, Bb, Bc) (Gong and Golic, 2004); сайты рестриктаз BamHI и HindIII обозначены серыми треугольниками

Использование данных рестриктаз и последующая гибридизация с зондами к 5' и 3' участкам гена бтш70 позволяет выявить изменения, происходящие со всеми копиями гена бтш70. Так как конструкция EPgy2 содержит на 5'- и 3'-концах сайты для рестриктазы HindIII, то появление инсерций в генах бтш70 в гетерозиготных линиях фиксировали как появление низкомолекулярного дополнительного фрагмента гибридизации. При этом наблюдали уменьшение интенсивности гибридизации той копии гена бтш70, в которую произошло встраивание. При выведении линий в гомозиготное состояние, полностью исчезает фрагмент, соответствующий исходной копии гена, и увеличивается интенсивность гибридизации нового фрагмента с инсерцией EPgy2. Нами не было зафиксировано ни одного случая внедрения конструкции в 3'-кодирующий или фланкирующий участок бтш70 (рис. 30Б); все встраивания произошли в 5'-район генов бтш70, расположенных в локусе 87А - бтш70Aa и Ab.

Нами было зарегистрировано 31 встраивание EPgy2 в гены бтш70 из 375 локальных перемещений конструкции для линий, выведенных из US-4, и 14 инсерций для линий, полученных из US-2 (из 160 проанализированных локальных перемещений).

5.3. Точная локализация полученных инсерций EPgy2. C помощью Саузерн-анализа было выявлено, что все инсерции EPgy2 происходят в 5'-районы генов бтш70 локуса 87А. Для точной локализации места встраивания были проведены полимеразные цепные реакции с разным набором праймеров с последующим секвенированированием полученных фрагментов. После серии ПЦР было доказано, что конструкция встраивается в регуляторную область бтш70. На рис. 31 приведен пример ПЦР для нескольких линий.

На дорожках 1 - 5 представлены результаты ПЦР для пяти разных трансгенных линий с праймерами из 5'-конца бтш70 (№2) и из 3'-конца EPgy2 (№7). Разный размер синтезированных фрагментов свидетельствует о разных местах встраивания.

Рис. 31 Локализация инсерций и ориентации конструкции EPgy2 методом ПЦР. А. ПЦР с праймерами: 2-7: 1 - линия 31IIa, 2 - 5IId, 3 - 111IIa, 4 - 1IIa, 5 - 134Ib; с праймерами 2-6: 6 - 1IIa; с праймерами к Р элементу и гену aur для идентификации исходной конструкции: 7 - 31IIa, 8 - 5IId, 9 - 111IIa, 10 - 1IIa, 11 - 134Ib. Б. Схематическое изображение встраивания EPgy2 в промоторную область гена бтш70Аа и праймеров, использованых для локализации инсерции.

Саузерн-анализ показал, что инсерции EPgy2 происходят в 5'-регуляторную зону генов бтш70 Aa и Ab. Для подтверждения транспозиции в ту или иную копию гена бтш70 были поставлены ПЦР с праймерами из 5'-кодирующей части бтш70 наружу (последовательность идентична для обеих копий гена бтш70 Aa и Ab) и праймерами из 5' и 3'-участков EPgy2 (№6 и 7). Соответственно, синтезировались фрагменты размером ~ 2.5 и 0.5 т.п.о. В качестве примера приведена картина ПЦР для линии 1IIа (на рис. 31А дорожки 4, 6). Секвенирование показало, что фрагмент размером 2.5 т.п.о. соответствует межгенному участку, примыкающему к гену бтш70Ab (см. схему на рис. 31Б.) Таким образом, инсерция в линию 1IIа произошла в регуляторный район гена бтш70Аа.

ПЦР-анализ с праймерами из инвертированного повтора конструкции и из гена бтш70, направленными внутрь и наружу гена, показал, что ни в одном случае не произошло инсерций в кодирующую и 3'-фланкирующую области генов бтш70.

Результаты анализа трансгенных линий, полученных из US-4 и US-2, показали, что во всех случаях транспозиции EPgy2 происходят с переворотом по отношению к стартовому элементу (рис. 32), в промоторную область генов бтш70 между -28 и -240 п.о. выше старта транскрипции. Проведенный анализ выявил «горячие точки» встраиваний EPgy2: 59% всех инсерций для US-4 и 40% для US-2 происходят в одну и ту же область промотора -96 и -97 п.о. от старта транскрипции. Результаты по локализации инсерций EPgy2 в гены бтш70 трансгенных линий представлены в таблице 3.

Встраивание EPgy2 исключительно в 5'-область генов бтш70 можно объяснить свойствами Р элемента и особой организацией промоторной области генов теплового шока (Nacheva, 1989). Из литературы известно, что предпочтительным местом встраивания Р элемента являются регуляторные области генов (Spradling, 1995), преимущественно несколько сотен п.о. от старта транскрипции генов (Liao, 2000).

Промоторные районы генов бтш70 обладают рядом свойств, делающих их уязвимыми для инсерций: в них отсутствует нуклеосомная организация и хроматин находится в деконденсированном состоянии. «Горячие точки» встраивания EPgy2, нуклеотиды -96, -97 выше старта транскрипции генов бтш70, также располагаются в особой области промотора.

In vivo, ДНК промоторных областей бтш70 находится в связанном состоянии со многими белками (GAF, TBF и др.), поддерживающими «открытую» структуру хроматина. Белки GAF способны взаимодействовать друг с другом таким образом, что ДНК оборачивается вокруг нескольких GAF (Georgel, 2005), при этом определенные участки ДНК оказываются «открытыми». Нуклеотиды -96, -97 находятся в центре такого участка ДНК (с -80 по -111 п.о.), образованного GAF. Также известно, что Р элемент предпочтительно встраивается в районы ДНК с повышенным содержанием CG-пар (Liao, 2000). Нами был выявлен 8-нуклеотидный сайт дупликации в месте инсерций EPgy2: CGGCGCAC при транспозиции в положение -97 выше сайта инициации транскрипции и GGCGCACT при транспозиции в положение -96. Таким образом, предпочтительное встраивание EPgy2 в 5'-область бтш70 и наличие «горячих» сайтов инсерций можно объяснить совокупностью многих факторов.

Большинство инсерций EPgy2 в промоторные области единичны; мы зафиксировали лишь два случая двойного встраивания - в линиях б198I и 30IIb. В обоих случаях двойное встраивание выявлено по результатам Саузерн-гибридизации. Методами ПЦР и секвенирования полученных фрагментов было установлено, что в линии а198I произошли внедрения EPgy2 в разные места 5'-регуляторных районов генов бтш70 (-160 п.о. гена Аа и -96 гена Аb). В линии 30IIb инсерции были зафиксированы выше -96 п.о. от старта транскрипции генов бтш70 Аа и Ab.

Таблица. 3 Сводная таблица локализации сайтов инсерций EPgy2 в гены бтш70 трансгенных линий, выведенных из исходных линий US-4 и US-2 (б). Знаком * обозначены линии с перестройками геномной ДНК

Получение гомозиготной линии 30IIb давало возможность исследовать влияние большой вставки (20 т.п.о.) на морфологию пуфа, образующегося в локусе 87А. Особое расположение генов бтш70Aa и Ab в виде сближенных инвертированных копий важно для быстрого начала транскрипции этих генов в условиях ТШ, поэтому увеличение расстояния между генами может влиять на характер функционирования генов бтш70 и вызывать изменение морфологии пуфа. По результатам иммунофлуоресцентного окрашивания хромосом (совместно с С. Г. Георгиевой), было установлено, что при активации транскрипции генов ТШ происходит изменение структуры пуфа в локусе 87А линии 30IIb по сравнению с линией Oregon R. В контрольной линии две инвертированные копии гена бтш70, расположенные в локусе 87А, при ТШ образуют одиночный пуф, в линии 30IIb этот пуф становится двойным (рисунок не приводится), т.о. происходит физическое отдаление двух копий гена бтш70 локуса 87А друг от друга, что может затруднять координированную регуляцию транскрипции этих генов.

5.4. Влияние инсерций EPgy2 на уровень транскрипции бтш70. Инсерции МЭ могут по-разному влиять на экспрессию генов. Из экспериментальных работ (Lerman, 2003; Lerman, 2005; Michalak, 2001) известно, что в природе встречаются популяции Drosophila, содержащие инсерции МЭ в промоторных областях генов бтш70. Эти инсерции нарушают нормальное функционирование тех копий генов бтш70, в которые произошло встраивание. Представлялось интересным оценить влияние встраиваний EPgy2 в гены бтш70 на уровень транскрипции этих генов.

В результате проведенной Нозерн-гибридизации нами было зафиксировано снижение уровня синтеза тотальной мРНК бтш70 в гомозиготных трансгенных линиях 30IIb (двойное встраивание в гены Аа и Аb в положение -96), 134Ib (встраивание в положение -28 в район ТАТА-бокса), по сравнению с контрольной линией US-4.

Снижение уровня синтеза РНК в трансгенных линиях было подтверждено методом количественного ПЦР в реальном времени (quantitative real time PCR) с праймерами, позволяющими различить группу генов бтш70А и бтш70В (рис. 33). На рис. 33А приведена картина экспрессии генов бтш70А после 30 мин ТШ 37ОС и 30 мин восстановительного периода при температуре 25ОС, нормализованных относительно рибосомального гена rp49. Этот эксперимент позволил выявить зависимость снижения синтеза мРНК от места встраивания (рис. 33). У D. melanogaster в регуляторной области генов бтш70 содержится 4 копии HSE (Jachansan A., 1987). Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, могут существенно снижать уровень транскрипции гена. Нами было показано, что при инсерции EPgy2 в район ТАТА-бокса (положение -28) уровень транскрипции двух генов локуса 87А, бтш70Аа и Ab, составляет лишь 44%, по сравнению с контрольной линией (уровень синтеза мРНК в линии US-4 принят за 100%); при инсерции в район -42 эти гены функционируют только на 51%; при двойном встраивании в положение -96 (линия 30IIb) - на 52%.

Согласно полученным данным, можно предположить, что при встраивании EPgy2 в ТАТА-бокс (положение -28) и в положение -42 (между ТАТА-боксом и HSE1) один из генов группы бтш70А перестает транскрибироваться; при двойном встраивании, вероятно, существенно нарушается транскрибирование обеих копий гена бтш70. При инсерциях в область -134 и -144 п.о. от старта транскрипции уровень синтеза РНК составляет, соответственно 81 и 97%. Таким образом, чем ближе к старту транскрипции происходит встраивание, тем существеннее снижение уровня синтеза РНК генов бтш70.

Рис. 33 А. Относительная экспрессия генов бтш70A (Aa и Ab) в трансгенных линиях (по оси ординат), определенная методом количественного ПЦР в реальном времени. В качестве контроля представлена линия US-4. РНК была выделена после ТШ (37ОС 30 мин) и последующего периода восстановления (25ОС 30 мин). Б. Уровень синтеза мРНК бтш70А у трансгенных линий относительно контрольной линии US-4 (принят за 100%). Цифрами указан нуклеотид относительно старта транскрипции гена бтш70, выше которого произошло встраивание