Автореферат: Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитания

оказалось, что, как и ожидали, фибробласты туркмен характеризовались значительно более высокой частотой выживания, по сравнению с фибробластами русских (Lyashko et al., 1994).

Ранее в работе Ульмасова (Ulmasov et., 1993) на лимфоцитах верблюда (Camelus dromedaries) было показано, что они способны синтезировать БТШ при более высоких температурах, по сравнению с лимфоцитами человека.

В сумме, результаты этих исследований свидетельствуют о том, что и у теплокровных организмов, обитающих в условиях жарких пустынь, выработались молекулярные механизмы для обитания в экстремальных условиях.

3. Внутривидовые различия по термоустойчивости на примере Drosophila melanogaster

При исследовании механизмов адаптации к высокой температуре у ящериц приходилось вести сравнение между филогенетически весьма отдалёнными видами, резко отличающимися по температуре экологических ниш. В связи с этим возникал вопрос: не обусловлены ли найденные различия в системе ответа на ТШ у видов, контрастных по температуре обитания, простой дивергенцией между видами (Garland and Adolph, 1994), либо они действительно вызваны адаптацией к высоким температурам среды обитания. С этой точки зрения наиболее корректно изучать эволюцию генов, кодирующих белки семейства БТШ70, их структуру и характер экспрессии у близкородственных видов, различающихся по климатическим условиям среды обитания и характеризующихся разным уровнем естественной термальной адаптации. Удобной модельной системой для изучения структуры и эволюции генов ТШ являются различные виды или популяции рода Drosophila.

Адаптация к ТШ у мух рода Drosophila, по-видимому, шла отличным путем, чем у ящериц. У разных видов ящериц мы обнаружили одинаковое число генов бтш70. У всех видов мух рода Drosophila произошла амплификация индуцибельного гена бтш70. Так, у D. auraria в единственном локусе находятся 3 копии бтш70, а виды D. simulans и D. mauritiana содержат в двух локусах по 2 тандемные копии БТШ70. У D. melanogaster произошла дальнейшая амплификация копий гена бтш70. При этом в локусах 87В и 87А расположено по 3 - 4 и 2 копии, соответственно. Структура кластера генов бтш70 у группы D. virilis не была изучена вовсе. В начале наших исследований мы остановили свой выбор на мухах вида Drosophila melanogaster. Для сравнения взяли хорошо изученную линию Oregon R (OR) и линию, обозначенную нами как Termotolerance (TT). Линия ТТ была отловлена в начале 70-х годов в центральном Чаде (Африка). В данной местности в марте-июне наблюдается колебание дневных температур в диапазоне 20 - 38 С. Как оказалось, мухи линии ТТ остаются фертильными и способными к развитию при 32С. Отловленные мухи линии ТТ в течение последних 20 лет велись в лабораторных условиях как при температуре 25С (линия Т25), так и при температуре 32С (линия Т32). При температуре выше 29С мухи OR, так же, как и все другие линии D. melanogaster, становятся стерильными. Ответ на ТШ у мух линии OR, в отличие от линий ТТ, подробно изучен. В связи с этим интересно было выяснить, отличается ли линия ТТ от OR только способностью развиваться при более высоких температурах, либо она характеризуется также более высокой устойчивостью к экстремальным шоковым воздействиям и отличается по уровню синтеза БТШ от OR.

3.1. Сравнение линий по термоустойчивости. Для ответа на этот вопрос были проведены опыты по определению критической температуры выживания (рис.10). Под критической мы понимаем температуру, при которой количество выживших мух составляет менее 1% от числа подвергнутых ТШ. Из рисунка 10A видно, что для OR критической является температура 40С, а для линий Т25 и Т32 - 40.5, 41С, соответственно. Примечательно, что при 40С выживает 75% мух линии Т32 и 25% - Т25. Известно, что предварительный слабый ТШ (35 - 37С) ведет к увеличению количества выживших мух после сильного ТШ и повышает на 1.5 - 2С критическую температуру выживания (индуцированная термотолерантность) (Krebs, 1999). Из рисунка видно (рис. 10Б, В, Г), что при индуцированной термотолерантности критическая температура выживания остается неизменной для всех рассматриваемых линий. С другой стороны, явно увеличивается количество выживших мух при температурах, близких к критической. Таким образом, установлено различие рассматриваемых линий по критической температуре выживания при схожести в динамике проявления индуцированной термотолерантности.

Рис. 10 Выживаемость мух в зависимости от ТШ (A) и индуцированной термотолерантности (Б, В, Г). По оси абсцисс указаны температуры теплового воздействия, по оси ординат - процент выживших мух через сутки после ТШ.

3.2. Сравнение уровня содержания БТШ70. Мы предположили, что основной причиной повышения термоустойчивости линий ТТ может являться повышенное содержание белков-членов семейства БТШ70. Для точного количественного определения содержания БТШ70 был использован метод иммуноферментного анализа (ИФА - ELISA). На рис. 11 представлено содержание БТШ70, накопленного в течение 1 ч восстановления после 30 мин ТШ. Представлено процентное содержание от стандарта БТШ70, выделенного из 20 нг белков, полученных из клеток Drosophila Schneider 2 после ТШ 36.5С и восстановления в течение 1 ч (25С). Результат анализа показывает, что в данных условиях OR, и ТТ достигают относительного пика индукции БТШ70 после ТШ 37С, причем у OR уровень накопления БТШ70 значительно больше, чем у ТТ.

Рис. 11 Количественный анализ содержания индуцибельного БТШ70 в зависимости от температуры ТШ

При более высоких температурах у OR индукция БТШ70 резко падает (до нуля при 39 С), при сохранении детектируемых данным методом количеств белка у линии Т32. После шока 38С индукция БТШ70 примерно одинакова для всех линий, поэтому данная температура была выбрана для изучения кинетики накопления БТШ70 во время восстановительного периода. Максимальное содержание БТШ70 достигается у обеих линий после 3 ч восстановления. В этом случае, у OR и Т25 накапливается белка примерно в три раза больше, чем после 1 ч. Падение до исходного уровня происходит между 5 и 6 ч. Таким образом, кинетика накопления индуцибельного БТШ70 в период восстановления после ТШ у разных линий одинакова, и различается по количеству синтезируемого БТШ70.

3.4. Анализ геномной ДНК линий ТТ и Oregon R. Обнаруженные различия в уровне индукции БТШ70 могут быть обусловлены отличиями в числе копий гена бтш70 и (или) в системе регуляции синтеза БТШ70. Для проверки первого предположения был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК (рис. 12). Была получена идентичная картина гибридизации с пробой к гену HSF. При обработке ДНК ферментами рестрикции BamHI и HindIII и гибридизации с фрагментом гена бтш70 D. melanogaster для ДНК OR наблюдается 5 фрагментов гибридизации, каждый из которых совпадает с определенной копией гена (один с двумя копиями). При этом для линий Т25 и Т32 видно также 5 полос, но 3 из них отличаются по подвижности от полос гибридизации у OR. В случае использования других рестриктаз картина гибридизации для OR и ТТ также различна. На основании примерно одинаковой интенсивности полос гибридизации можно предположить равное число копий гена бтш70 в сравниваемых линиях (у Oregon R - шесть копий).

Рис. 12 Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК c XbaI/BamHI фрагментом гена бтш70 D. Melanogaster

Важно было выяснить, вызваны ли различия в картине гибридизации рестрикционным сайт-полиморфизмом, либо произошли какие-то существенные изменения в структуре генов бтш70, приведшие к изменению уровня экспрессии БТШ70. Методом ПЦР у линии ТТ в 5'-районе одной из копий гена бтш70 была выявлена вставка. Оказалось, что в Ва-копию гена бтш70 между первым и вторым HSE произошло внедрение ретротранспозона Jockey (Zatsepina, 2001; Lerman, 2003). Последовательность депонирована в GeneBank под номером AY032740. Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания МЭ между этими элементами, особенно между HSE1 и HSE2, существенно (по нашим данным, примерно на 75%) снижают уровень транскрипции гена. Таким образом, снижение уровня экспрессии БТШ70 в линии ТТ можно объяснить внедрением МЭ в промотор одного из генов бтш70.

Сейчас убедительно показано, что повышение количества БТШ70 у D. melanogaster выше определенного уровня приводит к повышенной смертности во время развития (Feder, 1999). Таким образом, возможно, число генов и, соответственно, уровень индукции БТШ70 у D. melanogaster достиг оптимального уровня, а для дальнейшего повышения термоустойчивости вовлекаются другие механизмы.

3.5. Синтез белков при тепловом шоке. Картина синтеза БТШ70 для D. melanogaster до и после ТШ хорошо изучена. Наряду с белком с молекулярной массой 70 кДа, семейство БТШ70 включает также индуцируемый тепловым шоком белок с молекулярной массой 68 кДа, который кодируется уникальным геном, расположенным в локусе 95D (Palter et al., 1986). При этом, как индуцибельные (БТШ68 и БТШ70), так и конститутивно синтезируемые члены семейства БТШ70 имеют общие антигенные детерминанты, что обусловливает их совместное обнаружение методом иммуноблоттинга. Кинетику синтеза БТШ de novo после шока можно проследить, проанализировав включение in vivo 35S-L-метионина в белки слюнных желез личинок.

Из рис. 13 видно преимущественное включение метки после ТШ в белки семейства БТШ70, БТШ83 и низкомолекулярные БТШ (22 - 27кДа и 40 кДа). У линии ТТ повышена экспрессия низкомолекулярных БТШ (нмБТШ), по сравнению с OR, а также обнаруживается новая изоформа БТШ70 после ТШ. Чтобы однозначно определить, какие белки относятся к семейству БТШ70, был проведен иммуноблоттинг разделенных методом двумерного электрофореза белков с антителами 7.10.3 (Lindquist Lab.), узнающими индуцибельные и конститутивные члены семейства БТШ70. Результаты, отраженные на рис. 14, указывают на принадлежность рассматриваемых белков к семейству БТШ70.

Таким образом, анализ белков после ТШ методом двумерного электрофореза выявил следующие различия между линиями OR и ТТ: 1) снижение индукции БТШ68 у линии ТТ, по сравнению с OR; 2) при температурах ТШ, близких к критическим, у линии ТТ видна индукция дополнительных низкомолекулярных БТШ; 3) существование дополнительной изоформы БТШ69, принадлежащей семейству БТШ70, для линии ТТ. Таким образом, у линии ТТ повышение терморезистентности происходит не за счет увеличения накопления БТШ70, а, возможно, связано с индукцией дополнительного белка семейства БТШ70 (БТШ69), а также с повышенной экспрессией ряда низкомолекулярных БТШ.

4. Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов бтш70 у видов филады virilis, обладающих различной термальной адаптацией

Для дальнейших исследований были выбраны несколько видов Drosophila, относящихся к филаде virilis с мало изученной системой ответа на ТШ. Группа virilis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяет исследовать возможные этапы эволюции генов бтш70 путём анализа их структуры и сравнения ее со структурой генов других видов (D. melanogaster). Время дивергенции видов D. virilis - D. melanogaster ~ 50 миллионов лет. Данные виды обитают в различных климатических поясах и, соответственно, должны отличаться по приспособляемости к воздействию высоких температур. Сравнивали пары видов, контрастные по уровню термальной адаптации: D. virilis (южный) - D. lummei (северный) и D. novamexicana (южный) - D. texana (северный). Данные пары видов способны скрещиваться в лабораторных условиях с получением частично фертильного потомства. D. virilis является предковым видом всей группы видов virilis, в пределах которой хорошо изучены филогенетические отношения. Время дивергенции видов D. virilis - D. lummei составляет ~ 4 - 5 млн. лет. Можно предположить, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у этих близких видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены изменениями в ходе эволюционной дивергенции. В качестве дополнительного объекта исследования был взят вид D. montana (филада montana), распространенный в пределах Северной Европы и США и, вероятно, близкий по термочувствительности к D. lummei.

4.1. Изучение термоустойчивости. Для определения устойчивости к кратковременному интенсивному тепловому шоку использовали мух из популяции, поддерживаемой при 25°С.

Таблица 1 Значения LT50 и критической температуры для разных видов и линий группы virilis и вида D. mojavensis

Определяли LT50 и критическую температуру. Число выживших мух определяли через 48 ч после ТШ. Из таблицы 1 видно, что все изученные линии D. lummei и D. montana характеризуются меньшей термоустойчивостью, чем линии D. virilis.

В целом, значения LT50 и критической температуры для D. virilis на 1,0 - 1,5°С выше, чем для D. lummei и D. montana. D. novamexicana - вид, обитающий в условиях аридной зоны, проявляет более высокую термоустойчивость, чем D. texana, и схож по этому показателю с D. virilis.

4.2. Определение индуцируемой термоустойчивости у видов и линий группы D. virilis. В наших экспериментах по изучению индуцированной термоустойчивости мы подвергали мух предварительному ТШ интенсивностью 35,0, 36,0 и 37,0С в течение 30 мин. Тепловой шок высокой интенсивности давали через 1 ч, 3 ч или сразу после предварительного ТШ. У D. lummei индуцированная термотолерантность не обнаруживается. D. lummei - первый изученный вид Drosophila, у которого практически отсутствует индуцируемая термоустойчивость. Для D. virilis (предварительный ТШ 36 - 37С), была выявлена высокая индуцированная термотолерантность. Исходя из величины предварительного ТШ и данных по накоплению БТШ70 (см. ниже), можно предположить, что у D. virilis индуцированная термоустойчивость обусловливается индукцией и накоплением БТШ, предохраняющих клетки от более интенсивного ТШ.