Материал: Меледина Т.В., Давыденко С.Г. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Морфология, химический состав, метаболизм

ного и азотного питания она не метаболизируется. Однако неоспорима ее роль в лаг-фазе роста дрожжей. При наличии в среде необходимых для размножения субстратов трегалоза исчезает из клеток за 45 мин, после чего начинает утилизироваться глюкоза.

Влияние условий культивирования на синтез резервных углеводов

Синтез гликогена и трегалозы активизируется при переходе культуры из логарифмической фазы в фазу замедления роста, т.е. во время снижения удельной скорости роста дрожжей.

Скорость роста можно регулировать:

–путем ограничения размножения культуры дрожжей различными компонентами питательной среды (C, N, P, S и т.п.). Чаще всего эта цель достигается снижением дозировки либо азотного, либо углеводного питания, либо того и другого одновременно. Установлено, что при одной и той же скорости роста клетки, выращенные в условиях лимита глюкозы, содержат больше резервных углеводов, чем при недостатке азота;

–путем направления энергетического обмена дрожжей. Так, для преимущественного накопления трегалозы необходима высокая степень аэробности культуры, а главное – исключение катаболитной репрессии;

–путем создания определенных физико-химических условий культивирования (температуры, рН, осмотического давления). Увеличению содержания трегалозы в растущей культуре способствует повышение температуры. Можно также дифференцированно управлять синтезом гликогена и трегалозы в покоящихся дрожжах с помощью температуры. Оптимум температуры для накопления гликогена 30 °C, для трегалозы 45 °C. При такой температуре накапливается до 20 % трегалозы от абсолютно сухой массы клеток.

5.6.2. СТРУКТУРНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ

Клеточная стенка, состоящая из глюкана и маннанопротеидов, является активно функционирующей органеллой. Маннанопротеиды

56

и глюканы синтезируются разными путями. Первые синтезируются внутри клетки и по мере синтеза экскретируются и откладываются на поверхности. Глюкан, вероятно, синтезируется при участии цитоплазматической мембраны. Отмечается высокая подвижность компонентов, входящих в клеточную стенку. Так, при пересеве в свежую среду количество глюкана и маннанопротеидов сначала снижается, а затем стремительно возрастает. При этом наблюдается четкая корреляция между динамикой глюкана и резервного гликогена. Когда снижается количество глюкана, накапливается гликоген и, наоборот, накоплению глюкана сопутствует падение уровня гликогена в клетках.

Во время обезвоживания снижается содержание в дрожжах гликогена и маннана, тогда как доля трегалозы и глюкана возрастает. Это согласуется также с представлением о том, что соотношение между маннаном и глюканом определяет форму клетки. Если величина этого отношения меньше единицы, то клетки приобретают округлую форму, вероятно, в результате их обезвоживания.

5.6.3.БИОСИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ

Всостав белков дрожжей входят алифатические (глицин, аланин, серин, треонин, валин, лейцин, изолейцин, аспарагин, глутамин, лизин, аргинин, цистин и метианин), ароматические (тиразин, фенилаланин) и гетероциклические (пролин, гистидин и триптофан) аминокислоты.

Аминокислоты (АК) играют большую роль в процессе синтеза биомассы, а также в биосинтезе вторичных метаболитов, в частности высших спиртов и дикетонов.

Уровень ассимилируемого азота в среде определяет:

– скорость роста дрожжей;

– выход биомассы;

– скорость утилизации сахара;

– скорость брожения.

При наличии в среде утилизируемого азота дрожжи способны синтезировать все двадцать аминокислот, из которых строятся белки.

Дрожжи утилизируют аминокислоты, ди- и трипептиды, амми-

ачный азот. Нитраты, нитриты, аминокислоты белков дрожжами не

57

ассимилируются. При этом в качестве источника азота дрожжевые клетки предпочтительно используют аминокислоты, присутствующие в питательной среде или составляющие аминокислотный пул. В последнем случае аминокислоты находятся в вакуолях.

Состав аминокислот и их количество в аминокислотном пуле постоянно изменяется и зависит от внешних факторов, особенно концентрации ассимилируемого азота на предыдущих стадиях культивирования. Отсутствие лимита по азоту способствует повышению концентрации АК в посевном материале. Это тормозит приток их из внешней среды и предполагает выделение АК из клетки. Таким образом, даже при отсутствии в среде ассимилируемого азота могут происходить процессы, связанные с синтезом биомассы и вторичных метаболитов, однако эти процессы быстро завершаются. Второй причиной увеличения АК в дрожжах может быть автолиз клеток, который происходит при исчерпании экзогенного утилизируемого азота сусла. Например, увеличение содержания свободных АК в клетках связано с активацией внутриклеточных протеолитических ферментов. Обычно это происходит при попадании гидролитических ферментов, содержащихся в лизосомах, и образовании так называемых вторичных вакуолей, которые занимают более 2/3 объема клеток (см. рис. 3.7). Во избежание автолиза дрожжей питательную среду наряду с другими источниками питания необходимо дополнить утилизируемыми источниками азота в виде аминокислот и аммиачного азота.

Свободные аминокислоты, находящиеся в питательной среде, иногда не подвергаются изменениям и в небольшом количестве используются непосредственно в биосинтезе белка. Последовательность аминокислотной ассимиляции может значительно меняться от условий культивирования. Например, подъем давления приводит к снижению потребления валина, метионина, изолейцина, лейцина и гистидина. Однако большинство поступающих в клетку аминокислот подвергается действию трансаминазы, которая удаляет их аминогруппы, оставляя углеводный скелет, который метаболизируется. Основное место в системе трансаминирования у дрожжей занимает 2-оксоглутарат как акцептор аминогрупп; образующийся при этом глутамат может быть использован в качестве донора аминогруппы для построения других аминокислот из остатков, образованных при протекании анаболических путей.

58

Биосинтез нуклеотидов. Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды участвуют в синтезе нуклеиновых кислот, они входят в состав многих коферментов и участвуют в активации и переносе аминосахаров, аминокислот, компонентов клеточной стенки и липидов. Исходным метаболитом для их синтеза служит рибозо-5 фосфат.

5.6.4. ЖИРОВОЙ ОБМЕН

Липиды дрожжей представлены триацилглицеридами, фосфолипидами и стеринами. Триацилглицериды являются предшественниками длинноцепочечных жирных кислот и глицерина. Дрожжевые липиды содержат преимущественно жирные кислоты с 16 и 18 углеродными атомами.

Жирные кислоты могут быть насыщенными и ненасыщенными (с одной или двумя связями). В дрожжах преобладает содержание таких ненасыщенных аминокислот, как пальмитиновая (С 16:0) и стеариновая (С 18:0). Ненасыщенные жирные кислоты в основном представлены пальмитолеиновой (16:1), олеиновой (С 18:1) и линолевой (С 18:2) кислотами.

Фосфолипиды являются замещенными диацилглицерофосфатами, наиболее обычные заместители – холин, этаноламин, серин или инозит.

Липиды участвуют в регулировании окислительно-восстано- вительных процессов при дыхании клеток, входят в состав мембран всех органоидов клетки, в том числе мембран митохондрий, образуют липопротеиновый комплекс с белками, входящими в состав протоплазмы и т.д. При гидролизе одной молекулы АТФ в дрожжевой клетке может освободиться до 52 кДж.

Кроме того, липиды выполняют роль запасных веществ клеток дрожжей. Распад нейтральных липидов и фосфолипидов происходит за счет гидролитического действия липаз, в результате образуются глицерин и жирные кислоты. Глицерин далее фосфорилируется до глицеро-1-фосфата, дегидрируется до диоксиацетон-фосфата, который участвует в процессе гликолиза. Жирные кислоты подвергаются

-окислению в матриксе митохондрий. Жирные кислоты с короткой углеродной цепочкой, содержащей от 4 до 10 атомов углерода (ЖКК), проникают в митохондрию. Для длинноцепочечных жирных кислот (ЖКД) внутренняя мембрана непроницаема, они переходят в

59

матрикс в виде ацилкарнитинов, которые образуются во внутримембранном пространстве. В результате полного окисления пальмитиновой кислоты образуется 8 молекул Ац-КоА, которые далее поступают в ЦТК. Общий выход АТФ составляет 17 молекул на каждый фрагмент из двух углеродных атомов.

Преобладающие стерины – эргостерин и зимостерин, обнаружены и другие стерины и их эфиры. Все три вида липидов являются важными компонентами клеточной мембраны дрожжей. Так как клеточная мембрана контролирует проникновение в клетку питательных веществ и выделение метаболитов из клетки, еѐ функция необходима для роста и размножения клетки. Синтез стеринов также включает участие НАДФ+-зависимой смешанно-функциональной оксидазы. Потребность дрожжей в молекулярном кислороде более актуальна для синтеза стеринов, чем для образования жирных кислот. Недостаточная концентрация растворенного в среде кислорода уменьшает выход биомассы и снижает их жизнеспособность, так как клетки в этом случае не могут синтезировать ненасыщенные жиры для построения клеточной мембраны.

Синтез жирных кислот

Дрожжи могут усваивать жирные кислоты из питательной среды либо синтезировать их самостоятельно.

Исходным метаболитом в синтезе насыщенных жирных кислот является цитоплазматический Ацетил-КоА и диоксид углерода, которые под действием фермента Ацетил-КоА-карбоксилазы, содержащего простетическую группу биотин, превращаются в малонин-КоА – непосредственного предшественника 14 из 16 атомов углерода молекулы пальмитиновой кислоты. Коферментом ацетил-КоА-карбокси- лазы является Mn+2.

Реакция, катализируемая Ацетил-КоА-карбоксилазой, является лимитирующей стадией всего процесса синтеза жирных кислот. Биотин служит переносчиком молекулы СО2 в двухступенчатой реакции.

Первая ступень:

СО2 + АТФ + Биотин-фермент → Карбоксибиотин-фермент +АДФ+Ф Реакция катализируется также ионами марганца (Mn+2).

60