Начиная с середины 60-х годов исследователи перешли от поиска новых антибиотиков к модификации структуры уже имеющихся. Особенно это было характерно для пенициллинов и цефалоспоринов, структура которых включает -лактамное кольцо. Химическая модификация -лактамного кольца ("добавление" к нему какой-либо химической группы) позволяет получить новые виды антибиотиков; их называют полусинтетическими.
Ключевым полупродуктом для получения полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда является 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК)
Получение 6-АПК в промышленности путем химического гидролиза бензилпенициллина сопряжено с большими трудностями в связи с крайней неустойчивостью лактамного цикла его молекулы. Так, при щелочном гидролизе бензилпенициллина выход 6-АПК составляет всего 1 %. Продуктивность этого процесса удалось значительно повысить благодаря применению для гидролиза иммобилизованных бактериальных клеток, содержащих пенициллинацилазу.
Со второй половины 70-х годов XX в. вся 6-АПК, выпускаема в России, и значительная часть 6-АПК, получаемая в Италии производятся с помощью иммобилизованных ферментов. На итальянских фирмах применяют фермент, иммобилизованный путем включения клеток Е. coli в волокна триацетата целлюлозы, на российских предприятиях используют бактериальные клетки, иммобилизованные в полиакриламидном геле. Переход к технологии, применяющей иммобилизованные бактериальные клетки обеспечивает высокий выход 6-АПК, составляющий 80-85%. По данным японских исследователей, время полуинактивации пенициллинацилазы, содержащейся в иммобилизованных в полиакриламидном геле бактериальных клетках, равно 42 суткам при 30°С или 17 суткам при 400С.
Внедрение в промышленность биокаталитической технологии производства 6-АПК привело к существенному увеличению выпуска полусинтетических пенициллинов и снижению их себестоимости.
Для получения промышленных биокатализаторов с целью трансформации антибиотиков используют иммобилизацию клеток микроорганизмов путем включения в ПААГ, сшитый глутаровым альдегидом желатиновый гель, связывание с глицидилметакрилатом с помощью глутарового альдегида. По существу при трансформации антибиотиков из всего многообразия ферментов клетки используется лишь один из них. Сохранять жизнеспособность клеткам при этом не обязательно, активность катализатора можно увеличивать за счет разрушения клеточных оболочек, служащих диффузионными барьерами на пути субстрата к ферменту.
Тем не менее, простота требований, предъявляемых к системе, когда при иммобилизации нет необходимости сохранять жизнеспособность клеток, является кажущейся. В частности, простое включение в гель клеток E.coli приводит к быстрой инактивации биокатализатора вследствие вымывания фермента в процессе получения геля. В связи с этим был разработан способ включения в ПААГ клеток, предварительно модифицированных в растворе мономеров путем сшивки бифункциональным реагентом.
При включении клеток E.coli в гели альгината по стандартной методике их содержимое конкурирует с полимером за связывание с ионами кальция. Результатом является лизис клеток, нарушение интактности клеточных структур. Стабильность такого биокатализатора иллюстрируют катализаторы фирмы “Спофа”, полученные на основе разрушенных клеток E.coli.
Резкого повышения стабильности удается достичь после "фиксирующей" модификации поверхности клеток до их контакта с раствором, содержащим ионы кальция. Эта фиксация резко меняет картину ультраструктуры иммобилизованных клеток, их удается сохранить структурно неизмененными.
Мягкое воздействие на клетки E.coli органическими растворителями, замещающими часть воды в клетке, приводит к изменению проницаемости клеточной стенки, увеличению доступа субстрата к внутриклеточным ферментам и ускорению вывода продукта при одновременном сохранении целостности покровов клетки, и, как следствие, активность биокатализатора и его стабильность существенно возрастают. Воздействие на клетки в процессе выращивания (температурный фактор, химические агенты) также позволяет получить микроорганизмы с повышенной проницаемостью клеточных оболочек. Активность и стабильность иммобилизованного биокатализатора на основе таких клеток возрастает.
Для иммобилизации микроорганизмов, осуществляющих биосинтез антибиотиков, применяют разные методы - включение в ПААГ, гели Са-альгината, каррагинана, агара, коллагена, включение в полые волокна, адсорбция на цеолите, пенополиуретане, поликарбонате, нейлоне, полисульфоне, стали. Биосинтез антибиотиков с помощью иммобилизованных клеток не имеет пока промышленного значения, но исследования в этом направлении интенсивно развиваются.
Трансформация стероидов.
Одна из первых работ, посвященных иммобилизованным клеткам, касалась трансформации стероидов (в ней шла речь о гидроксилировании стероида кортексолона). В настоящее время все основные энзиматические процессы, используемые в стероидной химии, осуществлены с помощью иммобилизованных клеток: 1.2-дегидрирование, 11-- и 11--гидрокси-лирование, стереоспецифическое 17--восстановление, 20-- и 20--восстановление, дезацетилированние, трансформация стеринов и некоторые другие. Острая необходимость применения для трансформации иммобилизованных клеток обусловлена тем, что стереотрансформирующие ферменты, особенно гидролазы и гидрогеназы, являются весьма лабильными, их выделение и очистка затруднены. Иммобилизованные клетки могут служить в этих случаях "носителем" активных и стабильных полиферментных систем, регенерирующих необходимые им кофакторы.
Промышленный синтез многих лекарственных препаратов на основе стероидов стал возможен с развитием методов микробиологической трансформации. В качестве сырья для промышленных процессов используют природные стерины, выделяемые из растений или различных органов животных.
Трансформацию стероидов осуществляют с помощью различных микроорганизмов, для иммобилизации которых предложен широкий круг методов.
Максимальная стабильность и активность в непрерывном (проточном) реакторе наблюдается у клеток, адсорбированном на керамическом носителе, в условиях периодического реактора - у клеток, включенных в ПААГ. В случае иммобилизации в ПААГ период полуинактивации составил 5 мес. (160 циклов трансформации) при сохранении 95%-ного превращения гидрокортизона в преднизолон. Практически во всех носителях (кроме каррагинана) дегидрогеназная активность сохраняется на уровне активности свободных клеток, причем клетки в иммобилизованном состоянии остаются жизнеспособны.
Трансформация стероидов является одним из примеров реализованных в промышленности процессов, основанных на использовании иммобилизованных клеток.
В настоящее время интенсивно разрабатываются методы использования нерастворимых микрокристаллических стероидных субстратов для иммобилизованных клеток. В этих случаях применяют диспергирование и измельчение субстрата, а также превращение его в водорастворимое состояние (с помощью циклодекстринов). Предложен также новый метод проведения реакций, как для свободных, так и для иммобилизованных клеток и в двухфазных водно-органических системах. Клетки при этом локализованы в водной фазе (внутри гранул носителя) и мало подвержены воздействию органического растворителя, не смешивающегося с водой.
В качестве катализатора реакции дегидрирования стероидов в среде бензола и гептана используются различные виды бактерий Nocargia sp., иммобилизованные в гидрофобном носителе. Бактерии, включенные в гидрофобные гели (уретановые полимеры), обладают большей активностью и стабильностью, чем находящиеся в гидрофильном окружении, что определяется характером распределения субстрата между гелем и окружающим растворителем.
Наконец, следует отметить еще одну возможность утилизации нерастворимого стероидного субстрата, когда клетки и частицы субстрата одновременно включают в гранулы геля (альгината, агара, агарозы). После осуществления цикла трансформаций гранулы геля разрушают, клетки удаляют центрифугированием и рециклизуют, а продукт (преднизолон) экстрагируют из супернатанта органическими растворителями.
Получение ферментов.
С точки зрения применения иммобили-зованных клеток речь может идти в первую очередь о получении внеклеточных ферментов (производство в мире составляет сотни тысяч тонн в год), среди которых промышленно важными являются амилазы, целлюлозы, гемицеллюлазы, пуллуланазы, декстраназа, пектиназы, лактаза, липазы, протеазы. Внутри-клеточные ферменты - глюкозооксидазу, каталазу, аспарагиназу, пенницилин-ацилазу, инвертазу, -галактозидазу, глюкозоизомеразу, выделение которых требует разрушения клеточной стенки микроорганизма-продуцента, получать с помощью иммобилизованных микроорганизмов нецелесообразно.
По существу, из трех классических методов культивирования микро-организмов - на жидких питательных средах (глубинный), на твердых питатель-ных средах (поверхностный) и непрерывное культивирование - два последних можно с определенными оговорками отнести к методам, связанным с применением иммобилизованных клеток, которые закреплены на нерастворимом субстрате (источнике углерода) или отделяются от целевого продукта для последующего использования (рециклизуются).
Применение иммобилизованных клеток для утилизации отходов.
Утилизация разнообразных органических отходов, жидких стоков различных отраслей промышленности, сельского хозяйства, бытовой деятельности человека является чрезвычайно злободневной и острой проблемой, вклад в решение которой биотехнологических (микробиологических) методов трудно переоценить. Большую роль в очистке воды играют микроорганизмы-деструкторы пестицидов, поверхностно-активных веществ, нефтяных загрязнений ксенобиотиков и т.д. Микробиологическая очистка сточных вод способствует также получению альтернативных энергоресурсов и сырья, поскольку продуктом обработки во многих случаях является биогаз (смесь метана и углекислого газа в соотношении 3 : 1). Масштабы некоторых из биотехнологических очистных процессов огромны: уже существуют биореакторы емкостью 4000-5000 м3 и выше.
В основе биотехнологии очистки сточных вод лежат два подхода, в одном из которых используют аэробные, а в другом - анаэробные микроорганизмы. В аэробной очистке применяют активный ил (биопленку), представляющий собой скопление разнообразных микроорганизмов, видовой состав которых регулируется конкретными экологическими условиями. В большинстве случаев в развитых странах используют именно аэробную очистку.
Активный ил представляет собой темно-коричневые хлопья размером до сотен микрон, причем он состоит примерно на 70% из живых организмов и около 30% составляют частицы неорганической природы. Живые организмы вместе с твердым носителем, к которому они прикреплены, образуют так называемый зооглей-симбиоз популяций организмов, покрытый общей слизистой оболочкой. Зооглей может формироваться как за счет флокуляции, так и адгезии клеток на поверхности носителя. Микроорганизмы, входящие в состав активного ила, относятся к различным родам: Actinomyces, Actinobacter, Bacillus, Corynebacterium, Desulfiomaculum, Microcjccus, Pseudomonas, Sarcina и другие, которые окисляют спирты, жирные кислоты, парафины, ароматические углеводороды, нафтены, фенолы, осуществляют деградацию нефти (фенолы и формальдегид уже в незначительных концентрациях угнетают развитие микроорганизмов).
Аэробный способ очистки сточных вод основан на использовании системы из двух аппаратов: аэротенк и вторичный отстойник. Аэротенк - это открытое сооружение, через которое пропускается аэрируемая сточная вода и суспензия активного ила, в отстойнике же осуществляется доочистка воды. Применение активного ила по данной технологии относится, по существу, к методам, связанным с использованием иммобилизованных клеток. Однако кроме этого существуют промышленные методы использования активного ила, где иммобилизацию используют в "чистом" виде. Речь идет о биофильтрах, представляющих собой проточные емкости с принудительной или естественной циркуляцией, содержащие консорциум клеток активного ила, прикрепленных к поверхности пористого носителя, которым служит обладающая достаточной механической прочностью керамика, щебень, гравий, песок, керамзит, кольца Рашига, стекловолокно, нити синтетических волокон, металлические полимерные материалы.
Глубина и скорость очистки сточных вод в биофильтрах выше, чем в аэротенках (скорость в 10-15 раз выше и достигается практически полная очистка), однако содержание органики в очищаемых водах не должно превышать 500 мг/л (иначе трудно осуществить полную аэрацию биофильтра), кроме того, сточные воды перед биофильтром должны быть очищены от взвешенных частиц, в противном случае биофильтры быстро забиваются и происходит заиливание. Биофильтры целесообразно применять для очистки локальных стоков.
В последние годы конструкция биофильтров совершенствуется, например, в качестве носителя используют мелкозернистую полимерную или металлическую сетку. Биомассу клеток наращивают в пустотах внутри прокладок из пористого полиэфира, прокладки удерживают внутри реактора с помощью сеток и периодически удаляют из реактора. Густую биомассу отжимают, и пустые прокладки вновь возвращают в реактор. Запуск промышленных аэротенков и биофильтров в эксплуатацию занимает обычно десятки суток, время же их непрерывного функционирования составляет десятки месяцев.
Анаэробные способы очистки применяются, как правило, для обработки высококонцентрированных стоков и осадков, содержащих большое количество органических веществ. Процесс брожения осуществляется в метантенках. Анаэробное превращение органических веществ происходит под действием бактериальной микрофлоры (в ее состав входит до тысячи микроорганизмов) через четыре последовательных этапа: фаза гидролиза (расщепления) биополимерных молекул (белков, липидов, полисахаридов и других) на более простые, например, мономеры, аминокислоты, углеводы и другие; фаза ферментации мономеров до низших кислот и спиртов, аммиака, сероводорода; ацетогенная фаза (образование Н2, СО2, формиата, ацетата); непосредственно метаногенная фаза, которая ведет к конечному продукту расщепления - метану. Кроме метана, продуктом является углекислый газ (их смесь образует биогаз). В результате действия метанногенного консорциума микроорганизмов происходит резкое снижение концентрации органических загрязнений в отходах или сточных водах с одновременным образованием биогаза, который можно в дальнейшем использовать как энергоноситель или углеродный субстрат для синтеза микробной (кормовой) биомассы. Активное использование метаногенеза при сбраживании органических отходов является, по современным представлениям, одним из наиболее перспективных путей совместного решения экологических и энергетических проблем.