Все большее развитие получают технологические процессы с участием сложных энзиматических систем, включающих коферменты. Так, созданы ферментные мембранные реакторы, катализирующие непрерывные процессы с регенерацией НАДН (восстановительное аминирование кетокислот, восстановление б - кетокислот в б - гидроксикислоты). Разработаны системы разделения рацематов посредством стереоспецифического активного транспорта. Например, мембрана, содержащая гексокиназу и фосфатазу, функционирует как насос, избирательно прокачивающий лишь D-глюкозу. Применение сопряженных ферментативных реакций с участием алкогольоксидазы и каталазы дрожжей Hansenulla polimorpha и формальдегиддисмутазы бактерии Pseudomonas putida позволило осуществить окисление метанола в муравьиную кислоту с выходом 88- 94%. В промышленности большое будущее имеют ферменты, способные катализировать химические реакции в органической фазе (“каталитические антитела”), в частности липазы. Существенно, что каталитическая активность панкреатической липазы свиньи сохраняется при концентрации воды в реакционной среде, составляющей всего 0,015 %, и при температуре 100 °С. Препараты липазы используют для синтеза оптически чистых сложных эфиров и феромонов, применяющихся в парфюмерии и медицине.
Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют ферменты разных классов и в том числе лакказу, лигниназу, тирозиназу, монооксигеназу, диоксигеназу и др. Перспективна для очистки сточных вод новая технология, основанная на использовании реакции пластеинообразования, открытой А. Я. Данилевским в 1886 г. Сущность работ Данилевского состоит в экспериментальном доказательстве обращения протеолиза и возможности синтеза белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ряда протеолитических ферментов. Сточные воды содержат аминокислоты и пептиды, концентрация которых возрастает в результате гидролиза белковых компонентов отходов под воздействием пептидогидролаз микроорганизмов. Данная технология, активно внедряющаяся во
Франции, нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод.
Развитие клеточной и генной инженерии было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было целого набора специфических ферментов (рестриктаз, лигаз, синтетаз, ферментов избирательно разрушающих клеточную оболочку и др.). Так, в настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз.
Ферменты широко используют в медицине, например в заместительной терапии в составе лечебных препаратов. Пероральное введение фенилаланин-аммиак-лиазы снижает уровень фенилаланина в крови при фенилкетонурии. Протеолитические ферменты, амилазу и липазу применяют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и печени. В последние годы накопились данные об эффективности применения протеиназ в энзимотерапии злокачественных новообразований. Это объясняется большей проницаемостью мембран раковых клеток для гидролитических ферментов в сравнении с нормальными клетками, благодаря чему опухолевые клетки быстро лизируются при введении смеси протеиназ (препарат «папайотин»). Протеолитические ферменты - плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу используют для растворения тромбов в кровеносных сосудах и разжижении гноя; коллагеназу - для рассасывания рубцовых образований; эластазу - для задержки развития атеросклероза; лизоцим - для лечения конъюнктивитов; дезоксирибонуклеазу из стрептококка (стрептодорназа) - для лечения заболеваний верхних дыхательных путей и роговицы глаза.
L-аспарагиназу продуцируют Е. coli и Erwinia carotovora. Фермент используют при химиотерапии некоторых форм лейкемии. L-аспарагиназа отщепляет одну аминогруппу от аспарагина, превращая его в аспарагиновую кислоту. Избирательность действия фермента определяется потребностью некоторых форм опухолевых клеток в аспарагине, тогда как нормальные клетки в аспарагине не нуждаются.
Нейраминидазу получают при культивировании Vibrio cholera. Фермент отщепляет остатки N-ацетилнейраминовой кислоты, входящей в мембрану некоторых опухолевых клеток, повышая таким образом их антигенную активность. Может быть использован при лечении некоторых форм лейкемии.
в-лактамазы, инактивирующие пенициллины и цефалоспорины, используются при определении стерильности этих антибиотиков (см. ниже) или при микробиологическом анализе клинического материала от больных, получающих эти антибиотики. В терапевтических целях их используют в случае тяжелой аллергической реакции на в-лактамные антибиотики. Фермент вводят внутримышечно или внутривенно совместно с другими препаратами (адреналин, антигистаминные средства).
В 2004 г. появилось сообщение о том, что израильские ученые Вейцманнского института в Реховоте, добились значительных успехов в разработке микроскопических роботов, предназначенных для борьбы с тяжелыми заболеваниями и, в первую очередь, с раковыми опухолями. Созданные исследователями "наномашины" состоят из синтетических молекул ДНК и натуральных ферментов, а их размеры настолько малы, что в одном микролитре может уместиться до триллиона подобных устройств. Попав в кровоток, микророботы начинают путешествовать по организму, отыскивая злокачественные образования. Роль сенсоров при этом играет одна из частей ДНК, фиксирующая повышение уровня определенных рибонуклеиновых кислот (РНК). Аномальная концентрация РНК конкретного типа может свидетельствовать о начале развития раковой опухоли. Как только такая РНК обнаруживается, в дело вступает другой компонент "наномашины", подавляющий активность генов, приводящих к развитию болезни. Правда, в настоящее время о практическом применении предложенной методики речи не идет. Ученым удалось завершить только лабораторные тесты в пробирке, успешно идентифицировав клетки, ответственные за развитие рака простаты. И прежде чем "умное лекарство" сможет помочь людям, необходимо доказать его эффективность и безопасность, проведя эксперименты на отдельных тканевых культурах, простейших организмах и, наконец, млекопитающих. На это, могут уйти годы, и даже десятилетия.
Важнейшую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика - тестирование патологии того или того органа человека по уровню активности фермента или соотношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспартатаминотрансфераза, изоцитратдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа: альдолаза служат для выявления инфаркта миокарда; аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза и лактатдегидрогеаза - для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфера-1 - для блокировки отторжения органов при их пересадке и т.д. Таким образом, производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к тем ее отраслям, объем продукции, которых постоянно растет, а сфера применения неуклонно расширяется. По объему производства ферментов доминируют страны Западной Европы (фирма “Ново Индастри”, Дания), резкий рост этой индустрии наблюдается в США и Японии.
“КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА”: ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ОРГАНИЧЕСКОМ СИНТЕЗЕ
Благодаря разработке огромного количества методов создания углеродного скелета и его направленной функционализации в настоящее время при необходимости можно получать органические соединения практически любой степени сложности. Обычно синтез соединений сложной структуры осуществляют в несколько стадий. При этом решающим фактором, определяющим успех, является эффективность и однозначность каждой стадии. Эффективность реакции определяется ее скоростью и выходом продукта, а однозначность - ее регио- и стереоспецифичностью. Это позволяет получить максимально чистое вещество и избежать сложной процедуры выделения и очистки. По мере развития тонкого органического синтеза и получения все более сложных структур требования к эффективности и специфичности реакции непрерывно возрастают. При этом использование в многостадийных синтезах чисто химических методов нередко оказывается недостаточным. В последнее время для создания углеродного скелета соединений и его функционализации на отдельных стадиях синтеза все чаще стали применять ферментативные реакции.
Использование ферментов часто позволяет проводить реакцию быстрее и, благодаря их высокой регио- и, особенно, стереоселективности, чище. Поэтому методы ферментативного и химико-ферментативного синтеза быстро внедряются в практику тонкого органического синтеза. Препятствием для широкого использования биосинтетических методов часто является малая доступность природных ферментов нужной активности и специфичности. Это требует дополнительной трудоемкой работы по поиску подходящего и доступного источника фермента, разработке методов его выделения и очистки и детальному исследованию его специфичности. Поэтому в настоящее время в лабораторной и промышленной практике используется довольно ограниченный круг природных ферментов, катализирующих ограниченный круг химических превращений.
Давней мечтой химиков-органиков является получение искусственных ферментов с высокой эффективностью и, главное, с заданной избирательностью действия. Такие ферменты должны изготовляться в лаборатории и направленно использоваться для осуществления нужной реакции. Подобные искусственные ферменты заданной специфичности («tailor-made enzymes») позволили бы сильно повысить эффективность органического синтеза и открыли бы пути к получению новых классов органических соединений.
Природные ферменты являются высокомолекулярными белками с однозначной структурой. Их каталитическая активность и избирательность действия заданы строго определенной последовательностью аминокислот белковой цепи. Это, в свою очередь, предопределяет конформацию белковой молекулы и, в конечном счете, формирование пространственной структуры активного центра фермента.
Казалось бы, что наиболее простым путем получения искусственного фермента является его прямой синтез. Hо несмотря на общеизвестные успехи в синтетической химии белков, этот путь представляется малоэффективным не только из-за своей трудоемкости, но и потому, что требует информации о первичной структуре целевого белка-фермента. Однако определение аминокислотной последовательности само по себе является сложным и трудоемким исследованием.
Решением проблемы явился иной подход к получении искусственных ферментов с заданной специфичностью. Он основан на биосинтезе с использованием мощного иммунологического аппарата клетки, который отличается способностью синтезировать огромное разнообразие белковых молекул.
Как известно, иммунная система животных служит для биосинтеза антител - защитных белков, предназначенных для «нейтрализации» попавших в организм чужеродных молекул и более сложных комплексов, так называемых антигенов. Иммунная система создает белковую молекулу антитела, структура которого соотносится со структурой антигена таким образом, что активный центр антитела оказывается комплементарным специфической части антигена, так называемого гаптена. Антитело образует с антигеном достаточно прочный комплекс и тем самым «нейтрализует» его действие. Иными словами, биосинтетический аппарат иммунной системы делает возможным получение белковой молекулы, в которой формируется активный центр, структура и пространственное строение которого задаются структурой вводимого в организм антигена. Этот принцип и был использован для получения искусственных ферментов.
Согласно современным представлениям, каталитическое действие природного фермента заключается, в первую очередь, в облегчении перехода субстрата реакции из основного состояния в возбужденное переходное состояние. Последнее стабилизируясь в активном центре фермента, превращается далее в продукт или продукты реакции. Таким образом, для проявления каталитической активности в белковой молекуле должен, прежде всего, сформироваться активный центр, способный облегчить формирование и стабилизацию переходного состояния субстрата. Следовательно, при биосинтезе в иммунном аппарате антитела, обладающего каталитическими свойствами, нужно использовать антиген, строение которого моделирует переходное состояние, возникающее в каталитической реакции. Получить стабильную молекулу соответствующую переходному состоянию, невозможно, так как оно представляет собой неустойчивый комплекс. Поэтому в качестве антигенов, генерирующих каталитически активные антитела, были использованы соединения, молекулы которых по своей пространственной и электронной структуре имитировали переходное состояние. Будучи введенными в клетки иммунной системы, такие антигены: должны генерировать антитела, стабилизирующие переходное состояние соответствующей реакции и, следовательно, обладающие каталитическими свойствами подобно природным ферментам.
Хотя эта идея была высказана довольно давно, ее реализация вначале столкнулась с трудностями, так как в ответ на введение антигена клетки иммунной системы синтезируют большое количество антител («поликлональные антитела»). Трудности, возникающие при выделении из полученной сложной смеси близких по структуре белков антитела, обладающего наибольшей каталитической активностью и избирательностью, делали этот метод непригодным для практического использования.
Положение коренным образом изменилось, когда был открыт и детально разработан метод получения так называемых «моноклональных антител», количество которых и разнообразие более ограничено. В этом случае действительно удалось выделить антитела, обладающие каталитическими свойствами.
Таким путем около 10 лет назад были синтезированы первые антитела, получившие название «каталитических антител» (КА) или «абзимов» (сокращение английского «antibody enzymes»). С тех пор эта область стремительно развивается. В настоящее время получено уже около сотни КА, способных ускорять и специфически направлять реакции самого различного типа, и сформулированы основные принципы, используемые при генерации КА заданной специфичности. Все КА были подвергнуты тщательному исследованию методами ферментативной кинетики. Их физико-химические характеристики оказались сходными с характеристиками природных ферментов.