МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Инженерная энзимология
Учебное пособие по курсу "Биотехнология"
для студентов фармацевтического факультета
НИЖНИЙ НОВГОРОД 2005
УДК 615.014У79
Инженерная энзимология: Учебное пособие по курсу "Биотехнология" для студентов фармацевтического факультета. - Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2005.
Учебное пособие предназначено для ознакомления студентов с отдельными главами курса “Биотехнология”, посвященными применению в производстве, экологии и медицине чистых и иммобилизованных ферментных препаратов и клеток, полимерных биоматериалов а так же методов их получения и технологическом оформлении процессов на их основе.
Составлено на соответствии с программой по биотехнологии (Москва, 2001г.) и приказом МЗ РФ № 93 от 31.03.97 “О поэтапном введении с 1997 года итоговой государственной аттестации выпускников высших медицинских и фармацевтических вузов”
Составители: Османов В.К., Бирюкова О.В., Борисов А.В., Борисова Г.Н., Мацулевич Ж.В.,
Рецензенты: Османов В.К., Бирюкова О.В. Борисов А.В., Борисова Г.Н., Мацулевич Ж.В., 2005
энзимология инженерный иммобилизованный биоматериал
ВВЕДЕНИЕ
Ферментами обычно называют вещества биологического происхождения, представляющие собой соединения белковой природы и являющиеся специфическими катализаторами. По своей природе ферменты являются сложными соединениями. Для большинства из них структура не является до конца установленной. Однако существование так называемой белковой "составляющей" - неотъемлемой части биологического катализатора можно считать доказанным для большинства промышленно получаемых ферментных препаратов. Практически все попытки "очистить" эти препараты от соединений белковой природы приводили к потере их каталитической активности.
Все основные источники ферментов можно разделить на три основные группы:
1. Ткани животных как отход мясоперерабатывающей промышленности. Прежде всего, это богатые ферментами поджелудочная железа и слизистая оболочка желудка.
2. Некоторые растения. Например, такие гидролитические ферменты, как папаин и рицин извлекают соответственно из сока дынного дерева и инжирного дерева, из ячменя - амилазу.
3. Микроорганизмы.
Выбор источника получения того или иного фермента предполагает учет ряда требований, предъявляемых к чистоте получаемого препарата, потребности в нем, стоимости сырья, проведения процессов выделения и очистки готового продукта.
Из всех вышеперечисленных источников ферментов наибольшее практическое значение имеют микроорганизмы - продуценты ферментов. Их широкое использование обусловлено, прежде всего, их доступностью, возможностью организовать более эффективное промышленное производство на относительно дешевом сырье и управление, процессом биосинтеза, используя, различные продуценты ферментных препаратов. Использование микроорганизмов значительно расширило круг получаемых ферментных препаратов с различным спектром действия. Только с их помощью удалось получить такие ферменты, как целлюлазы и глюкозоизомеразы.
В качестве продуцентов ферментов, как правило, выбирают те штаммы-мутанты, полученные путем направленной селекции, которые обеспечивают максимальный выход целевого продукта при использовании стандартного оборудования. При этом штаммы-мутанты получают как традиционным путем с использованием таких широкоизвестных методов воздействия, как облучение УФ светом, г- и рентгеновскими лучами, обработкой клеток различными химическими агентами: этилимином, диметилсуфатом, гидроксиламином, диазометаном, оксидом азота и пр., изменением температуры и величины рН, так и методами генной инженерии.
В качестве продуцентов ферментов могут использоваться различные микроорганизмы. Для получения амилолитических и протеолитических ферментных препаратов в промышленности наиболее часто используют различные штаммы гриба рода Aspergillus и бактерий Bacillus. У бактерий короче цикл развития, на их основе легче получать мутанты.
Технология получения ферментных препаратов микробным синтезом обязательно включает в себя стадию промышленного культивирования соответствующего микроорганизма. В условиях промышленного производства значительное количество продуцента получают одним из следующих двух способов:
- культивирование на твердых питательных средах (поверхностный способ выращивания продуцента),
- культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способ выращивания продуцента).
Рис. 1 Принципиальная технологическая схема процесса глубинного культивирования микроорганизмов 1 - смеситель питательной среды; 2 - колонна для непрерывной стерилизации потока питательной среды острым паром; 3 - теплообменник - выдерживатель; 4 - теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 - инокуляторы (посевные аппараты); 6 - индивидуальный фильтр для очистки воздуха, подаваемого в инокулятор; 7 - реактор - ферментер; 8,9 - насосы; 10 - масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 - компрессор; 12- головной фильтр для очистки воздуха
ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) вне клеток, поэтому их традиционно широко применяют в практике. Биологические катализаторы нетоксичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи, с чем их применение в промышленности выгодно с экономической и экологической точек зрения.
По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из нескольких тысяч известных в настоящее время ферментов наиболее широко в промышленности используются различные гидролазы, которые можно разделить на четыре основные группы ферментных препаратов.
I. Амилолитические ферментные препараты
К этой группе препаратов относятся б- и в-амилазы и глюкоамилаза. Их используют для гидролиза крахмала и гликогена. В процессе гидролиза сначала образуются более простые полисахариды - декстрины, а в последующем - глюкоза. При этом б-амилаза гидролизует без определенного порядка б-1,4-глюкозидные связи с образованием декстринов, мальтозы и глюкозы, в-амилаза отщепляет остатки мальтозы, а глюкоамилаза - остатки глюкозы от концевых частей молекул полисахарида.
Наиболее широкое применение эти препараты нашли в пищевой промышленности (производство патоки и глюкозы).
2. Протеолитические ферментные препараты
Эта группа ферментов относится к гидролазам. Они обладают такой важной особенностью, как высокоселективное воздействие на некоторые пептидные связи белковых молекул и пептидов. Например, пепсин способствует гидролизу пептидных связей с остатками ароматических аминокислот, трипсин катализирует гидролиз пептидной связи между остатками аминокислот аргинина и лизина. Ферментов, входящих в этот класс, очень много. Их классифицируют, в основном, по способности проявлять максимум ферментативной активности в определенной области рН раствора. Кислые протеазы проявляют максимум активности в интервале рН раствора от 1,5 до 3,0, нейтральные - 6,5-7,5, щелочные - от 8,0 и выше.
Протеазы нашли свое применение в различных отраслях народного хозяйства: в пищевой и легкой промышленности (предварительная обработка свежего сырого мяса и шкур, животных в кожевенной промышленности), в химической промышленности при получении синтетических моющих средств с добавками протеолитических ферментных препаратов, в здравоохранении при лечении некоторых воспалительных процессов, ожогов, тромбозов,
3. Пектолитические ферментные препараты
Пектолитические ферментные препараты используются для расщепления пектиновых веществ, содержащихся в стеблях растений (льна), в различных корнеплодах, фруктах. К ним относятся пектин, пектиновые кислоты и протопектин. Пектиновая кислота - это полимер галактурононой кислоты. Пектин - это полностью или частично этерифицированная метиловым спиртом пектиновая кислота. Протопектин представляет собой комплекс с целлюлозой и белковыми веществами. Строение комплекса пока полностью не установлено.
Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20000 до 200000.
Все пектиназы делятся на две группы - гидролазы и трансэлиминазы. Первые катализируют процесс отщепления метоксильных групп (пектинэстераза) или обеспечивают разрыв б-1,4-гликозидных связей (полигалактуроназы). Вторые осуществляют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей (пектинтрансэлиминазы).
Препараты нашли свое применение в легкой промышленности при вымачивании льна, в пищевой промышленности (осветление вин, консервирование фруктовых соков).
4. Целлюлолитические ферментные препараты
Целлюлолитические ферментные препараты используются при обработке целлюлозы. Сама целлюлоза или клетчатка представляет собой полисахарид общей формулы (С6Н10О5)n и содержится в клеточных стенках растений. При степени полимеризации n=10 образует кристаллическую решетку. Нитевидные молекулы, взаимодействуя между собой, образуют прочные структуры - фибриллы. В объеме таких фибрилл существуют упорядоченные кристаллические участки, где молекулы расположены параллельно друг другу и связаны водородными связями, сущеcтвуют также участки с неупорядоченной структурой - аморфные.
Микроорганизмы способны синтезировать целый комплекс целлюло-литических ферментов, которые последовательно катализируют процесс гидролиза целлюлозы до глюкозы. В ферментном комплексе различают три группы ферментных препаратов: Ci-фактор, Сx-фермент и целлюбиазу.
Целлюлолитические ферментные препараты нашли применение в целлюлозно-бумажной промышленности, медицинской промышленности (получении лекарственных веществ - стероидов из растений), в пищевой промышленности (при производстве растительных масел) и в сельском хозяйстве (в качестве добавок к кормам жвачных животных).
По прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза, применяющиеся для приготовления обогащенных фруктозой кукурузных сиропов и составляющие около 50 % рынка пищевых энзиматических препаратов.
На коммерческий уровень поставлено ферментативное разделение рацемических смесей аминокислот и эфиров терпенов. Такие смеси образуются при химическом синтезе, и разделение их по оптическим свойствам составляющих имеет важное практическое значение. Известно, что для этого можно использовать традиционные физико-химические и химические методы (хроматография; механическое разделение, избирательное взаимодействие энантиомеров с другими оптически активными веществами), но гораздо более эффективными и удобными оказываются процессы, основанные на стереоспецифичности ферментов. Рассмотрим некоторые из используемых приемов.
1. Избирательное ацилирование аминов L-аминокислотами под действием ферментов папаина, бромелина или фицина.
Образующийся анилид L-аминокислоты нерастворим в воде и может быть легко отделен от D-изомера, а затем подвергнут гидролизу.
2. Асимметричный гидролиз. В этом случае осуществляется стереоспецифический гидролиз производных аминокислот, в результате которого образуется только один энантиомер. Эфиры L-аминокислот гидролизуют протеолитическими ферментами (химотрипсином); нужный продукт и не вступающие в реакцию D-эфиры разделяют по растворимости.
3. Использование амидаз. Эти ферменты из почек и поджелудочной железы млекопитающих или из микроорганизмов стереоспецифически гидролизуют амиды L-аминокислот. Образующуюся L-кислоту и непрореагировавший D- изомер затем разделяются методом дифференциальной растворимости. Амиды менее склонны к самопроизвольному гидролизу, чем эфиры, поэтому получаются более чистые препараты аминокислот.
4. Стереоспецифический гидролиз N-ацил -L-аминокислот под действием аминоацилазы или карбоксипепсидазы, приводящий к образованию L-аминокислот.
Принципы избирательного гидролиза аксиально или экваториально расположенной простой эфирной группы под действием ферментов лежит и в основе разделения рацемических смесей эфиров и терпенов.
Весьма перспективным представляется использование ферментов в качестве датчиков вредных и ядовитых веществ. Так, в качестве индикатора на фосфорорганические отравляющие вещества нервно-паралитического действия применяется холинэстераза. Ее так же возможно использовать и для определения многих пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии ОВ или пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами.
Аналогично карбонгидраза весьма чувствительна к хлорпроизводным алифатических, а гексокиназа - ароматических углеводородов.