За последние годы все возрастающее значение для медицины и биотехнологии приобретают «умные» полимеры. Так называют полимеры, способные реагировать (сжиматься или набухать) на небольшие изменения во внешней среде (температура, рН, электрическое поле и т.д.). «Умные» полимеры с иммобилизованными БАВ используются для выделения лекарств при определенных условиях, как правило, при заданной температуре или рН. Обычно «умные» полимеры получают традиционными методами, однако в последнее время, для этой цели стала использоваться также радиационная полимеризация. Среди «умных» полимеров наибольшее число публикаций посвящено поли(N-изопропилакриламиду) (поли-N-ИПАА). Данный полимер имеет в воде нижнюю критическую температуру растворения (НКТР) ~32°С, т.е. близкую к температуре человеческого тела. Выше 32°С происходит фазовое разделение, обусловленное конформационным переходом макромолекулы поли-N-ИПАА из рыхлой глобулы в компактный клубок, что сопровождается резким уменьшением размеров макромолекулы.
Было изучено поведение гидрогелей, полученных на основе поли(N-изопропилакриламида) и скорость диффузии иммобилизованных в них лекарственных препаратов в условиях имитирующих человеческий организм. Было установлено, что при 370С и рН=1,4 (нормальные условия в желудке человека) происходит медленное выделение иммобилизованных в гидрогель индометацина и амилазы, но при изменении величины рН до 7,4 (условия в кишечнике) выделение лекарств значительно ускоряется. Таким образом, можно создавать лекарственные формы, позволяющие доставлять препарат к пораженному органу без значительных потерь.
Другим направлением использования таких “умных” полимеров является создание сигнал-чувствительных систем, состоящих из биосенсора, активатора и резервуара для коррекции нарушений в работе различных органов в организме человека. Так для больных диабетом разрабатываются специальные системы с биосенсором на глюкозу, которые запускаются по принципу включение - выключение для выделения определенных порций инсулина, иммобилизованного в гелях, т.е. работающие по принципу поджелудочной железы.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ N-АЦЕТИЛАЛАНИНА: ПРИМЕР ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНОГО ПРОЦЕССА
Цель работы: ознакомление с методами ферментативного разделения оптических изомеров аминокислот, овладение лабораторными навыками проведения таких процессов, определение выхода целевого продукта.
Теоретическая часть: Биологические процессы катализируются ферментами. Многие ферменты обладают высокой каталитической селективностью и могут селективно катализировать реакции только с одним из энантиомеров в рацемате. В современной химии ферменты используются во многих процессах in vitro, особенно в синтезе оптически чистых продуктов. В данном эксперименте изучается гидролиз N-ацетилаланина в присутствии фермента ацилазы I.
За ходом реакции можно следить, если в реакционную смесь добавить нингидрин, который взаимодействует с образующимся аланином, давая яркое пурпурное окрашивание раствора:
Ход работы:
Растворите рацемат N-ацетилаланина (262 мг; 2,0 ммоль) в 10 мл воды. Медленно, при осторожном перемешивании прибавляйте раствор моногидрата гидроксида лития (84 мг; 2,0 ммоль) в воде (4 мл) до тех пор, пока рН раствора не станет равным 7. Контролируйте рН лакмусовой бумагой. В течение 2 минут, при интенсивном перемешивании прибавьте раствор ацилазы I (10 мг) в воде (водный раствор ацилазы I готовится следующим образом: навеска фермента добавляется к 5 мл воды, затем раствор отфильтровывается на стеклянном фильтре, покрытом диатомитом). После этого доведите объем раствора водой до 20,0 мл (точно). Поместите реакционную смесь в водяную баню (37°С) на 60 минут. Затем перенесите ровно 0,25 мл (для этого используйте шприц или мерную пипетку) реакционной смеси в пробирку и добавьте туда нингидрин (Sigma N 1632) (1,25 мл). Эту смесь нагревайте в кипящей воде в течение 20 минут, при этом появится интенсивная пурпурная окраска. После охлаждения аккуратно добавьте содержимое пробирки к буферному раствору, состоящему из 4 М литий-ацетатного водного буфера (рН = 5,2) и диметилсульфоксида в соотношении 1:3, находящемуся в мерной колбе на 250 мл. Доведите объем раствора до 250 мл. Измерьте оптическую плотность на спектрофотометре при л = 592 нм. В качестве стандарта используйте раствор нингидрина в том же литий-ацетатном бу-
фере в диметилсульфоксиде. (е пурпурного комплекса = 13350 л . Моль-1 . см-1)
Запишите следующие данные:
1. Начальную концентрацию рацемического N-ацетилаланина.
2. Значение оптической плотности при л = 592 нм.
3. Используя закон Бугера-Ламберта-Бера, рассчитайте количество аланина (в ммоль), образовавшегося в результате ферментативной реакции.
4. Рассчитайте степень превращения.
5. Если позволяет время, остановите реакцию и определите концентрацию аланина через 10, 25, 40 и 60 минут после начала реакции. Постройте график зависимости концентрации аланина от времени и оцените оптимальное время проведения реакции.
Контрольные вопросы
1. Будет ли образующийся аланин оптически активен: да или нет?
2. Будет ли непрореагировавший N-ацетилаланин: (1) оптически неактивен, (2) обогащен одним из энантиомеров, (3) оптически чист, если степень превращения меньше 50%?
3. Будет ли непрореагировавший N-ацетил аланин: (1) оптически неактивен, (2) обогащен одним из энантиомеров, (3) оптически чист, если степень превращения составит ровно 50%?
4. Достижима ли степень превращения больше 50%, да_или нет?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2
В ПОЛУЧЕНИЕ 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ ГИДРОЛИЗОМ БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИНА С ПОМОЩЬЮ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПОЛИАКРИЛАМИДНЫЙ ГЕЛЬ
Цель работы: ознакомление с технологией получения 6-амино-пенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллина с помощью иммобилизованного фермента, овладение лабораторными навыками проведения процессов с иммобилизованными ферментами, определение выхода продукта.
Теоретическая часть:
6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) является полупродуктом в химическом синтезе ряда полусинтетических антибиотиков. Современная технология получения 6-АПК складывается из следующих основных стадий:
1. Получение биомассы клеток микроорганизма E.coli, содержащих фермент пенициллинацилазу.:
2. Выделение и очистка фермента пенициллинацилазы.
3. Иммобилизация фермента в полиакриламидный гель.
4. Получение 6-АПК.
Последняя стадия включает в себя проведение следующих операций:
а) гидролиз бензилпенициллина с помощью иммобилизованного фермента; б) осветление гидролизной жидкости углем и отделение угля;
в) осаждение 6-АПК в изоэлектрической точке;
г) фильтрация и промывка полученного осадка 6-АПК водой и органическим растворителем;
д) вакуум-сушка готового продукта.
Клетки микроорганизма E.coliI выращивают методом глубинной ферментации в течение 24 ч. в слабощелочном растворе при температуре 25°С, при постоянном перемешивании и аэрации, на среде, содержащей очищенный кукурузный экстракт и фенилуксусную кислоту. По окончании ферментации клетки E.coli отделяют от культуральной жидкости сепарацией. Полученную пасту направляют на переработку с целью извлечения из неё фермента. Для этого проводят следующие технологические операции:
а) извлечение пенициллинацилазы из клеток Е.coli экстракцией нагретым до 400С O,9%-м раствором бутилацетата в воде при рН=8 и отделение отработанных клеток фильтрацией;
б) осаждение неактивных примесей (балластных белков) из бесклеточного экстракта;
Процесс проводят при температуре 5-8°С путем добавления к экстракту до концентрации 20% сухого сульфата аммония, полученный раствор перемешивают в течение 0,5 ч и отделяют выпавшие балластные белки сепарацией;
в) осаждение активного белка (фермента) и его отделение;
Для этого к осветленному на предыдущей операции экстракту при температуре 5-8°С вновь добавляют до уровня 12% сульфат аммония и полученную смесь выдерживают до 20 ч, из экстракта выпадает осадок, содержащий преимущественно целевой фермент пенициллинацилазу, который впоследствии отделяют от маточника сепарацией и направляют на вакуум-сушку;
г) вакуум-сушка полученного фермента.
Приготовленный таким образом ферментный препарат подвергают иммобилизации в полиакриламидный гель.
Получение иммобилизованной пенициллинацилазы состоит в радикальной сополимеризации акриламида и N, N'-метилен-бис-акриламида в водной среде в присутствии инициаторов - персульфата аммония (NH4)2S2O8 и N, N,N',N' -тетраметилендиамина. В реакционную смесь вводится бифункциональный реагент- глутаровый альдегид (ГА) под действием которого молекулы фермента-коваленню связываются с мономерами и сшиваются друг с другом.
Приготовление иммобилизованного фермента завершают промывкой полученного геля водой.
Процесс получение 6-АПК включает в себя последовательное проведение ряда вышеуказанных операций, выполнение которых и составляет экспериментальную часть данной лабораторной работы.
Ход работы:
Гидролиз бензилпенициллина под действием иммобилизованного фермента можно представить следующим стехиометрическим уравнением;
Гидролиз проводят в стеклянном пятигорловом реакторе, снабженном водяной "рубашкой”. В реактор введена мешалка, электроды и термокомпенсатор рН-метра.
В реактор заливают 100 см3 дистиллированной воды. В рубашку реактора из термостата подают нагретую до температуры 41°С воду. В реактор вносят точную навеску (5 г) соли бензилпенициллина и включают мешалку. После полного растворения соли в раствор вносят I мл концентрированной ортофосфорной кислоты, 15 г гель-фермента и производят начальный отсчёт времени. Момент внесения фермента считает началом времени гидролиза.
В течение гидролиза реакционную смесь подвергают достаточно интенсивному перемешиванию.
Гидролиз проводят при значениях рН в пределах 7,5-7,6, величина которого поддерживается добавлением из бюретки 12,5%-го раствора гидроксида аммония. По ходу процесса каждые 15 мин записывают объем, пошедшей на подтитровку щелочи.
С течением времени скорость гидролиза уменьшается и в зависимости от активности фермента процесс заканчивается через 1,5-2 ч. Окончание гидролиза определяется по установившемуся постоянному значении рН раствора.
По завершению гидролиза реакционную смесь выгружают из реактора на воронку Бюхнера, где осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр.
Освобожденный от гель-фермента гидролизат переливают в мерный цилиндр, измеряют его объем и переносят в коническую колбу вместимостью 500 мл. Содержимое колбы охлаждают до температуры 40С в токе холодной воды или на водяной бане со льдом.
Далее проводят осветление гидролизата активированным углем. Для этого в колбу с охлажденным гидролизатом вносят активированный уголь марки "Е", взятого из расчета на каждые 100 мл гидролизата по 1г угля. После внесения угля содержимое колбы в течение 15 мин перемешивают. Затем уголь отделяют от гидролизата фильтрованием на, воронке Бюхнера. Осветленную жидкость переливают в химический стакан вместимостью 250 мл в токе холодной воды или в бане с тающим льдом и охлаждают до температуры 6-8°С. После этого стакан устанавливают на столик магнитной мешалки, вводят электроды и_термокомпенсатор рН-метра. При включенной мешалке из бюретки по каплям добавляют 18-20%- ую соляную кислоту до тех пор, пока значение рН не достигнет 3,9-4,1.В. Этом интервале значений начинают выпадать кристаллы 6-АПК.
Стакан с реакционной массой снимают с мешалки, переносят в баню со льдом или холодильник, где выдерживают не менее 2 часов.
Полученный осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и дважды промывают охлажденной до 4-ЗсС дистиллированной водой порциями по объёму примерно вдвое больше объема полученного осадка.
Промытый водой осадок подсушивают на той же воронке Бюхнера и дважды промывают ацетоном порциями по объёму вдвое большими, чем объем осадка.
Ацетон тщательно отсасывают и 6-АПК переносят в предварительно взвешенную чашку Петри, изготовленную из тонкого, стекла или пластмассы.
Окончательное высушивание продукта производят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 45-50°С и остаточном давлении 2,5-4,0; кПа до постоянной массы.
По окончании работы оценивают выход 6-АПК в расчете на прогидролизованнный бензилпенициллин. Для этого по химическому уравнению гидролиза бензилпенициллина и количеству израсходованной щелочи сначала находят число разложившихся молей бензилпенициллина. Далее определяют процентное соотношение массы полученного выше осадка 6-АПК, пересчитанное на число молей, к количеству молей прогидролизованного бензилпенициллина.
Контрольные вопросы
1. Каковы основные технологические стадии получений 6-АПК с помощью иммобилизованных ферментов? Дайте их краткую характеристику. Каково назначение 6-АПК?
2. Какие продукты (основные и побочные) могут получаться в результате гидролиза бензилпенициллина?
3. Каковы Ваши предложения по утилизации фенилуксусной кислоты, остающейся в гидролизате после осаждения из него кристаллов 6-АПК?
4. Каковы основные стадии процесса получения иммобилизованного фермента пенициллинапилазы? Какова роль персульфата аммония и глутарового альдегида при получении иммобилизованного фермента?