Во-первых, был положен конец представлению об исключительной роли белков в катализе биохимических реакций. В настоящее время установлено, что рибозимы играют важнейшую роль в процессах синтеза и превращения РНК, например в процессах сплайсинга у эукариот и способны осуществлять практически весь спектр ферментативных реакций (рестрикция, сшивка, трансформации и др.). В настоящее время рибосому тоже принято рассматривать как рибозим. Действительно, все имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о том, что синтез полипептидной цепи белка в рибосоме катализируется рибосомной РНК, а не рибосомными белками. Идентифицирован каталитический участок большой рибосомной РНК, ответственный за катализ реакции транспептидации, посредством которой осуществляется наращивание полипептидной цепи белка в процессе трансляции.
Во-вторых, это позволило существенно пересмотреть взгляды на механизмы возникновения жизни и на ранние этапы эволюции. В частности в последнее время активно обсуждается гипотеза “Мира РНК”, как противовес классической теории академика А.И. Опарина. В частности гипотеза “Мира РНК” позволяет решить проблему, на которую долго закрывали глаза практически все ученые- сторонники теории академика А.И. Опарина, а именно, каким образом случайно получившиеся, единичные, удачные белковые молекулы могли копироваться и воспроизводиться в коацерватной капле, а тем более передаваться коацерватам - потомкам.
Накопление знаний о генетическом коде, нуклеиновых кислотах и биосинтезе белков привело к утверждению принципиально новой идеи о том, что все начиналось вовсе не с белков, а с РНК. Нуклеиновые кислоты являются единственным типом биологических полимеров, макромолекулярная структура которых, благодаря принципу комплементарности при синтезе новых цепей, обеспечивает возможность копирования собственной линейной последова-тельности мономерных звеньев, другими словами, возможность воспроизведения (репликации) полимера, его микроструктуры. Поэтому только нуклеиновые кислоты, но не белки, могут быть генетическим материалом, то есть воспроизводимыми молекулами, повторяющими свою специфическую микро-структуру в поколениях.
По ряду соображений именно РНК, а не ДНК, могла представлять собой первичный генетический материал.
Во-первых, и в химическом синтезе, и в биохимических реакциях рибонуклеотиды предшествуют дезоксирибонуклеотидам; дезоксирибонуклеотиды - продукты модифи-кации рибонуклеотидов.
Во-вторых, в самых древних, универсальных процессах жизненного метаболизма широко представлены именно рибонуклеотиды, а не дезоксирибонуклеотиды, включая основные энергетические носители типа рибонуклеозид-полифосфатов (АТФ и т.п.).
В-третьих, репликация РНК может происходить без какого бы то ни было участия ДНК, а механизм редупликации ДНК даже в современном живом мире требует обязательного участия РНК-затравки в инициации синтеза цепи ДНК.
В-четвертых, обладая всеми теми же матричными и генетическими функциями, что и ДНК, РНК способна также к выполнению ряда функций, присущих белкам, включая катализ химических реакций. Таким образом, имеются все основания рассматривать ДНК как более позднее эволюционное приобретение - как модификацию РНК, специализированную для выполнения функции воспроизведения и хранения уникальных копий генов в составе клеточного генома без непосредственного участия в биосинтезе белков.
После того как были открыты каталитически активные РНК, идея первичности РНК в происхождении жизни получила сильнейший толчок к развитию, и была сформулирована концепция самодостаточного мира РНК, предшествовавшего современной жизни. Возможная схема возникновения “Мира РНК” представлена на рис.2.
Абиогенный синтез рибонуклеотидов и их ковалентное объединение в олигомеры и полимеры типа РНК могли происходить приблизительно в тех же условиях и в той же химической обстановке, что постулировались для образования аминокислот и полипеп-тидов. Недавно российскими учеными (Институт белка РАН) было экспериментально показано, что, по крайней мере, некоторые полирибонуклеотиды (РНК) в обычной водной среде способны к спонтанной рекомбинации, то есть обмену отрезками цепи, путем транс-эстерификации. Обмен коротких отрезков цепи на длинные, должен приводить к удлинению полирибонуклеотидов (РНК), а сама подобная рекомбинация способствовать структурному многообразию этих молекул. Среди них могли возникать и каталитически активные молекулы РНК. Даже крайне редкое появление единичных молекул РНК, которые были способны катализировать полимеризацию рибонуклеотидов или соединение (сплайсинг) олигонуклеотидов на комплементарной цепи как на матрице, означало становление механизма репликации РНК. Репликация самих РНК-катализаторов (рибозимов) должна была повлечь за собой возникновение самореплицирующихся популяций РНК. Продуцируя свои копии, РНК размножались. Неизбежные ошибки в копировании (мутации) и рекомбинации в самореплицирующихся популяциях РНК создавали все большее разнообразие этого мира. Таким образом, предполагаемый древний мир РНК - это самодостаточный биологический мир, в котором молекулы РНК функционировали и как генетический материал, и как энзимоподобные катализаторы.
Рис. 2 Гипотеза А.И. Опарина гипотеза ”Мир РНК”
В настоящее время в природе известно только восемь рибозимов, обладающих достаточно низкой каталитической активностью по сравнению с белковыми катализаторами. Возможно раньше, рибозимов было гораздо больше, и они обеспечивали все многообразие необходимых для биосинтеза реакций, а затем они исчезли в процессе эволюционного отбора наиболее эффективных способов хранения и обработки наследственной информации. Что касается низкой эффективности катализа рибозимами, то у эволюции, было, достаточно времени и ее начальные стадии могли проходить очень медленно.
В настоящее время в лабораториях разных стран проводятся работы по искусственному синтезу различных рибозимов. Наибольших успехов достигла группа во главе с Д. Бартелом. Используя разработанную ими селекс-технологию (метод эволюции искусственного мира РНК в пробирке) они синтезировали 65 новых рибозимов и сумели повысить их активность в десятки и сотни раз.
В третьих, рибозимы могут использоваться как высокоэффективные лекарственные препараты направленного действия для генной терапии. В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические
системы с использованием олигонуклеотидов. Небольшой олигонуклеотид может либо гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию (“антигенные” или “антисмысловые” нуклеотиды) либо разрушать их (дезоксирибозим или рибозим).
Создание «терапевтического» рибозима - сложный процесс. Связано это с трудностью получения больших количеств синтетических РНК и сохранения их в нативном состоянии в клетке-мишени. Модифицируя субстрат - связывающую последовательность нуклеотидов с помощью методов генной инженерии, получают рибозимы, расщепляющие специфические мРНК и подавляющие трансляцию белка, ответственного за развитие того или иного заболевания. Рибозимы, созданные методами генной инженерии, можно использовать для лечения рака и вирусных инфекций.
Природных ДНК-ферментов (дезоксирибозимов) пока не обнаружено, но уже синтезированы олигодезоксинуклеотиды, обладающие каталитической активностью. Преимущество дезоксирибозимов состоит в том, что для их получения не нужно использовать экспрессирующий вектор: ДНК-ферменты можно просто упаковать в липосомы и доставить в клетку-мишень. Однако создание эффективных ДНК-ферментов находится пока на начальном этапе развития.
.ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ, ЕЕ ЗАДАЧИ
Инженерная энзимология -- это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответствующих целевых продуктов. Биообъект здесь - фермент (или комплекс ферментов).
Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использования. Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли - инженерной энзимологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения.
На практике обычно используют иммобилизованные ферменты (реже - иммобилизованные клетки), благодаря чему стабилизируется и пролонгируется их ферментативная активность. Иногда инженерную энзимологию отождествляют с биотехнологией. В этом содержится большая доля истины, так как все реакции в клетках катализируются ферментами. Однако слово "инженерная" привносит свою специфику, заключающуюся в акценте на создание конструкции (от франц. engin - машина), в данном случае - на конструирование биокатализаторов с заданными свойствами с последующим использованием в биотехнологическом процессе.
В частности, методами белковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной структуры природной молекулы фермента посредством химической модификации самого энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химические свойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Описанным способом получены термостабильные формы лизоцима Т-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменена в 100 раз), созданы гибридные формы ферментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочетающие в себе свойства в-галактозидазы и в -галактокиназы.
Многие проблемы технологии синтеза органических соединений, пищевой и медицинской промышленности, мониторинга человека и окружающей среды, защиты окружающей среды, энергетики не могут быть решены без использования методов современной инженерной энзимологии.
Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разработка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ
Иммобилизованными ферментами называются ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства.
Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахароза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем.
В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.
Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего, такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65 °С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффектив-ность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.
Носители для иммобилизации ферментов
По Дж. Порату (1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционно-способную форму).
Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечисленным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носителей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.