Получение L - аминокислот из их рацемических смесей.
Наряду с микробиологическими способами важное значение имеют химические методы промышленного получения природных аминокислот, в том числе незаменимых. Однако в результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот, содержащих асимметрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как D-, так и L-стереоизомеры, т. е. всегда возникает рацемическая смесь. Между тем в живых клетках обмену подвергаются лишь L-аминокислоты. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) явилось первым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов. Этот процесс был осуществлен в Японии в 1969 г. (компания «Танабе Сейяку») с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соединений в данном превращении используют N-ацилированные производные D-,L-аминокислот, получаемые с помощью химического синтеза. Вследствие своей стереоспецифичности аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляя от него ацильный радикал, в результате чего растворимость образующейся L-аминокислоты резко возрастает и ее легко можно отделить от своего антипода физико-химическими методами. При нагревании оставшаяся N-ацил-D-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в исходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента:
Аминоацилаза строго специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна и та же установка с иммобилизованным ферментом используется для получения различных аминокислот, в том числе L-валина, L-метионина, L-фенилаланина и L-триптофана. Время полуинактивации иммобилизованного энзима составляет 65 суток; на японских предприятиях он используется без замены более 8 лет и обеспечивает снижение стоимости производства аминокислот на 40 % по сравнению с технологией, где применяются свободные молекулы фермента.
Получение L-аспарагиновой кислоты.
Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химическим путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии (фирма «Танабе Сейяку»); в ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки Е. coli, содержащие аспартат-аммиаклиазу.
Полиакриламидный гель с иммобилизованными микробными клетками формуют в виде кубиков размером 2 - 3 мм, которыми заполняют колонку объемом 1 м3. Через колонку пропускают раствор фумарата аммония. При подкислении выходящего из колонки элюата до рН 2,8 и охлаждении до 150С из него выкристаллизовывается аспарагиновая кислота в виде препарата 100 %-ой чистоты. Процесс получения аспартата полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Производительность процесса - 1700 кг чистой аспарагиновой кислоты в сутки на |реактор. Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность фермента на 80 % в течение 120 дней и на 50 % в течение 600 дней работы реактора, в то время как свободные клетки -- всего на протяжении 10 дней с уровнем активности 25 % от исходной. В Армении был налажен промышленный процесс получения аспартата особой степени чистоты с использованием иммобилизованной аспартат-аммиак-лиазы на базе научных разработок химфака МГУ им. М. В. Ломоносова (1974).
Получение L-аланина. В настоящее время основной промышленный способ получения L-аланина - ферментативное декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты:
Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-в-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных в полиакриламидном геле, каррагинане или полиуретане. Установка, разработанная японской фирмой «Танабе Сейяку», производит этим способом 10 тонн аланина в месяц. Усовершенствование процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух последовательно расположенных реакционных колонках. На первом этапе фумарат аммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает в-декарбоксилирование с образованием аланина.
С помощью иммобилизованных клеток Serratia marcescens из треонина и глюкозы синтезируют L-изолейцин, а с помощью иммобилизованных клеток Corynebacterium glutamicum - L-глутаминовую кислоту из L-глюкозы; L-триптофан - из индола; L-орнитин - из L-аргинина.
Таким образом расширение производства аминокислот стало возможным благодаря изменению технологии получения промышленных биокатализаторов и снижению затрат при их производстве.
Получение органических кислот.
Органические кислоты и их соли широко используются в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной, химической, металлургической и других отраслях промышленности, поэтому их получение является важным направлением крупнотоннажного микробиологического синтеза. Многие кислоты можно производить как химическим, так и микробиологическим путем, причем первый путь более предпочтителен, когда кислоты предполагается использовать для технических нужд, второй путь - для целей пищевой промышленности и медицины.
Источником углерода для микроорганизмов-продуцентов органических кислот являются углеводы, органические кислоты, спирты, алканы. Кислоты часто секретируются клетками, когда рост культуры в силу определенных причин тормозится и переходит в стационарную фазу.
Фактором, вызывающим прекращение роста микробных культур, может быть недостаток минеральных компонентов или витаминов. В случае получения органических кислот рост культур лимитируют источником азота, используя при этом избыточное количество источника углерода (и энергии). Интенсивный синтез кислот в стационарной фазе роста после исчерпывания дефицитного компонента продолжается до тех пор, пока в среде присутствует источник углерода и пока клетки продуцента жизнеспособны. Это в принципе позволяет надеяться на широкое применение иммобилизованных клеточных препаратов для получения органических кислот.
Хотя свойство продуцировать ту или иную органическую кислоту широко распространено среди микроорганизмов, на практике для получения кислот используют специально отобранные или мутантные высокопродуктивные штаммы, не синтезирующие побочных продуктов. В этих случаях выходы органических кислот - по существу, монопродуктов процесса - являются высокими: для молочной кислоты 90, глюконовой - 90-95, уксусной - 90-98, лимонной - 85%.
В настоящее время семь органических кислот производятся в промышленных масштабах, причем лимонную, глюконовую, кетоглюконовую, итаконовую и яблочную кислоты получают только микробиологическим путем, а молочную и уксусную - химическим и микробиологическим методами.
Важнейшей для промышленности органической кислотой является уксусная. Она используется при производстве волокон, фармацевтических препаратов, инсектицидов, в пищевой промышленности, как субстрат для получения аминокислот. Микробиологический способ экономически оправдан в случае получения пищевого уксуса (окисление этанола ацетобактериями). Производство столового уксуса (10%-ная кислота) составляет в мире 8-10 млн. м3 в год. Техническую уксусную кислоту получают химическим синтезом (карбонили-рование метанола).
В зависимости от способа иммобилизации (адсорбция на буковых стружках, TiO2, ZrO2, керамике, хлопке, ионообменных смолах, включение в гели каррагинана, коллагена) продуктивность процесса варьирует в пределах 60 раз, концентрация уксусной кислоты изменяется от 20 до 110 г/л, операционная стабильность иммобилизованного биокатализатора достигает 270 сут. Иммобилизованные на древесной стружке ацетобактерии применяются в промышленности; ряд биокатализаторов, полученных на основе использования других способов иммобилизации, успешно испытан в установках и реакторах пилотного масштаба.
Молочная кислота - первая из органических кислот, которую начали производить путем брожения, в конце XIX века было налажено промышленное производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий (Lactobacillus debrueckii, L.Leichmanii и L.bulgaricus). Молочную кислоту используют в качестве добавки к пищевым продуктам, сокам, эссенциям и напиткам, как окислитель в пищевой промышленности, в гальваностегии, а также при производстве пластмасс, когда L(+)форму кислоты полимеризуют в полилактам. За 1980г. в США и Европе было произведено 40 000 т молочной кислоты. Следует отметить, что практически вся производимая в США молочная кислота синтезируется химическим путем, в Европе половину ее получают при сбраживании глюкозы L.delbrueckii. Для интенсификации процессов получения молочной кислоты проводят исследования по применению иммобилизованных молочнокислых бактерий, а также по оптимизации конструкции биореакторов.
Молочнокислые бактерии были иммобилизованы путем включения в различные гели. Для получения молочной кислоты предложено использовать мембранный реактор, колонный реактор с полыми волокнами, колонный реактор с иммобилизованными включением в Са-альгинатный гель бактериями, соединенный с электродиализной ячейкой. Имеющиеся данные позволяют рассчитывать на 50-100-кратное увеличение производительности процесса. Время полужизни иммобилизованного Са-альгенатбиокатализатора на основе L.delbrueckii составляет 100 сут.
Лимонную кислоту получают из мелассы с помощью микроскопических грибов Aspergillus niger. В 1980 г. ее мировое производство составило 175 000 т. Лимонная кислота применяется как ароматизирующее средство и консервант пищевых продуктов, для очистки и шлифовки металлов (хелатирующий агент), в качестве пластификатора лакокрасочных материалов. Эфиры лимонной кислоты применяются при производстве пластмасс. В лабораторных условиях иммобилизация А.niger проводилась в гелях Са-альгената, каррагинана, агара, полиакриламида, путем адсорбции на полипропиленовых пленках и пластинках , включением в поперечно-сшитую глутаровым альдегидом коллагеновую мембрану. Применение иммобилизованных клеток приводит к увеличению скорости образования лимонной кислоты в несколько раз, операционная стабильность иммобилизованного биокатализатора достигает 30 сут.
Лимонную и изолимонную кислоты получают с помощью дрожжей Candida sp. Изолимонная кислота синтезируется и при использовании Penicillium janthinellum (некоторые виды Penicillium синтезируют диастереомер лимонной кислоты - аллозо-Ls -изолимонную кислоту). В лабораторных условиях осущест-влена иммобилизация указанных микроорганизмов в Са-альгинат и ПААГ.
Хорошие результаты по технологическому применению иммобилизованных клеток продемонстрированы при получении яблочной кислоты путем микробиологической трансформации фумаровой кислоты. С 1974 г. японская фирма “Танабо Сеяку” приступила к промышленному выпуску яблочной кислоты с использованием включенных в ПААГ мертвых клеток Brevibacterium ammoniagenes. В 1978 г. ПААГ был заменен на каррагинан, что позволило в 2,3 раза увеличить эффективность биокатализатора, а замена В.ammoniagenes на В.flavum еще в 2 раза увеличила его эффективность. В итоге появилась возможность с помощью однократно приготовленной партии иммобилизованного биокатализатора получить до 100 т яблочной кислоты (в настоящий момент производится 180 т). Продолжительность функционирования иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток составляет около 60 суток, в геле на основе каррагинана - до 160 суток против 6 суток для свободных клеток. Конверсия фумарата (1М) - до 70%, время одного трансформационного цикла - около 5 ч. Глюконовая кислота и ее лактон являются продуктами окисления глюкозы. Промышленное производство глюконовой кислоты с помощью А.niger было налажено еще в начале 20-х годов. Выход процессов ферментации (свободные клетки) с получением глюконовой кислоты равен 95%, концентрация глюкозы - 150-200 г/л. Глюконовая кислота находит применение как моющее средство, ее соли используются в медицине, а лактон - как подкислитель в пищевой промышленности. Производные глюконовой кислоты - 2-кетоглюконовую и 5-кетоглюконовую кислоты - получают с помощью микроорганизмов Pseudomonas sp., Gluconobacter sp., Acetobacter sp., причем процесс получения 2-кетоглюконовой кислоты на основе свободных клеток нашел промышленное применение. Из 5-кетоглюконовой кислоты в результате химической гидрогенизации образуется L-идоновая кислота, а из нее осуществляется ферментативный синтез 2-кетогулоновой кислоты, являющейся полупродуктом для производства аскорбиновой кислоты.
Иммобилизацию микроорганизмов-продуцентов глюконовой и 2-кетоглюконовой кислот проводят с помощью адсорбционных методов (при использовании в качестве адсорбентов нейлонового волокна, керамики, анионообменника амберлита), а также включением в гели каррагинана, Са-альгината, коллагена, ПААГ.
Наиболее эффективны биокатализаторы, полученные методами включения в упругие гели ПААГ или Са-альгината, при их использовании были реализованы процессы превращения глюкозы, концентрацией до 200 г/л с продуктивностью до 10 г/лч (по глюконовой кислоте), продолжительность функционирования иммобилизованных клеток достигала 200 сут.
Итаконовую кислоту, применяющуюся при производстве пластмасс и красителей, получают с высоким выходом из глюкозы с помощью грибов А.terreus (процесс на основе свободных клеток внедрен в промышленную практику в СССР). На лабораторном уровне проводилась иммобилизация А.terreus в ПААГ, а также путем адсорбции на сетчатых дисках из пористой нержавеющей стали. В последнем случае использовался дисковый реактор: концентрация итаконовой кислоты достигала 20 г/л, реактор функционировал без изменения продуктивности, которая составляла до 1 г/л.ч, до 30 сут.
Получение антибиотиков. Применение биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток позволило достичь больших успехов в области получения антибиотиков. Как важна область биотехнологии, связанная с синтезом антибиотиков, наглядно видно из стоимости мирового сбыта их четырех наиболее распространенных групп ( пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов и эритромицинов ( имеется в виду продажа для медицины и ветеринарии): в 1978 г она составляла свыше 4 млрд. дол., в 1980 г. - около 7 млрд. дол., в 1985 г. - около 8 млрд. дол. ( объем производства превысил 60 тыс. т в год), в 2000 г. более 20 млрд. дол.
Важность и масштабы производства антибиотиков обусловлены их применением в медицине и ветеринарии как противомикробных и противоопухолевых препаратов. С их помощью контролируется рост растений и ведется борьба с болезнями.
Новые поколения синтетических антибиотиков представляют собой сложные по химическому строению вещества, поэтому методы получения на основе полного химического синтеза не могут конкурировать с методами, в которых используются микроорганизмы. Шесть родов филаментозных грибов синтезируют около тысячи различных антибиотиков, в том числе цефалоспорины и пенициллины. Два рода нефиламентозных бактерий синтезируют 500 видов антибиотиков, а три рода актиномицетов - около 3 000 видов. Число известных антибиотиков увеличивается на несколько сотен каждый год.