Автореферат: Иммунобиологические свойства термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия патоген–хозяин

Среди методов диагностики инфекционных заболеваний в последнее время все шире используется детекция генетических маркеров, ассоциируемых с патогенностью, к которым, в частности, относятся «островки патогенности».

В этой связи нами проведена амплификация с бактериальной ДНК Enterobacter spp. с праймерами к генам “островков патогенности” E.coli, контролирующими их способность к образованию фимбрий типа S (sfaA, sfaG), типа Р (рарС, рарАН), капсулообразованию (kpsMT), продукции гемолизинов (hlуА, hlуВ) и термолабильного энтеротоксина (Lth).

Удалось установить факт наличия у протестированных микроорганизмов фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности E.coli. В частности, из 34 исследованных штаммов образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hly A имело место в 7 случаях (20,5%), hly B - в 8 (23,5%) , pap AH - в 4 (11,8%), pap C - в 5 (14,7%) случаях, sfa G и sfa A обнаружены у 2 (5,9%) и 8 (23,6%) штаммов соответственно (рис.5). Фрагменты, специфичные генам kps MT и Lth, обнаружены не были.

Рис.5. Частота обнаружения по результатам ПЦР фрагментов генов «островков патогенности» у клинических штаммов Enterobacter spp. (%)

Результаты исследования показали, что количество обнаруженных генов у штаммов, выделенных при желудочно-кишечной патологии, относительно здоровых людей составляет - 9 (ч2=4,38; р=0,04), у штаммов, изолированных при урологической патологии, - 7 (ч2=2,92; р=0,09), а у штаммов, выделенных при гнойно-воспалительных процессах, - 10 (ч2=7,64; р=0,01), т.е. имеются различия по источникам выделения в генах «островков патогенности».

Среди штаммов Enterobacter spp., изолированных от здоровых людей, встречались гены, специфичные только hlyA, hlyВ, papC и и sfaA.

Таким образом, среди штаммов Enterobacter spp., вне зависимости от источника их выделения, обнаруживаются гены hlyA, hlyB, papAH, papC, sfaG и sfaA. Это указывает на то, что между патогенными и непатогенными микроорганизмами постоянно осуществляется генетический обмен благодаря трансформации, трансдукции и конъюгации. Полученные результаты исследования дают основание полагать, что штаммы, относящиеся к разным видам и даже родам, содержат гены, кодирующие их токсигенность и вирулентность, фланкированные в состав кластеров “островков патогенности”. Это указывает на универсальный тип кодирования факторов патогенности и, соответственно, на схожий механизм развития патогенеза инфекционного процесса, обусловленного разными патоварами УПЭ.

Резюмируя выше изложенное, можно констатировать, что фенотипические признаки ряда факторов патогенности и наличие генетических детерминант, входящих в состав общих “островков патогенности”, позволяет клинические штаммы Enterobacter spp. рассматривать как конкретные патовары. Их богатый патогенный потенциал дает возможность Enterobacter spp. выживать в экологической нише, прикрепляться и колонизировать эпителиальные поверхности, способствуя противостоянию механизмам поддержания гомеостаза хозяина.

Изучение фенотипических проявлений факторов патогенности, экспрессируемых генетическими детерминантами хромосомной и нехромосомной природы, конечно, не исчерпывает всех аспектов, связанных с механизмами их патогенного действия, и констатирует факт только их этиологической значимости.

Как известно, возбудитель инфекционного процесса отличается значительной сложностью и неспецифичностью, что определяет многообразие клинических проявлений. Выяснение этих вопросов позволит определить наиболее уязвимые звенья иммунной системы хозяина и, возможно, связать их с локальными особенностями в цепи патогенеза заболевания и разработать наиболее рациональный этиопатогенетический принцип лечения инфекционных болезней и профилактики дизбиотических состояний, связываемых с УПЭ.

В качестве модели для изучения закономерностей функционирования системы “хозяин-патоген” мы использовали штамм E.cloacae №258, депонированный нами в ФГУН ГНИИСК имени Л.А. Тарасевича, обладающий продукцией термолабильного энтеротоксина. Выбор энтеротоксигенного штамма E.cloacae был обусловлен тем, что в патогенезе инфекционных заболеваний, вызванных УПЭ, ведущим фактором является его токсин.

Для выявления и характеристики дифференциального действия LT- энтеротоксина E.cloacae на клетки хозяина в инфекционном процессе был использован и липополисахарид клеточной стенки, который, наряду с термолабильным энтеротоксином, является мощным, но отличным по своей антигенной структуре иммуномодулятором.

Как известно, фагоцитоз является эффективным фактором специфической защиты организма.

Поэтому нами проведены исследования фагоцитарного звена иммунитета, позволившие констатировать факт нарушения функции макрофагов, которое сопровождалось снижением активности и интенсивности фагоцитоза в экспериментальных группах.

Результаты представлены на рис. 6.

Рис.6. Показатели активности (%) и интенсивности (усл.ед.) фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей в динамике

*-данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05

Процесс фагоцитоза сопровождается активацией лизосомальных ферментов. Результаты наших исследований показали, что в I группе мышей, зараженной супернатантом токсигенной культуры E.cloacae, содержащей LT-энтеротоксин, прослеживается своеобразная динамика. Максимальная активация лизосомальных гранул происходит в 1 день, а быстрое “опустошение” ферментов лизосом - на 3 день исследования. Результаты отражены на рис.7.

Рис.7. Состояние лизосомальной активности перитонеальных макрофагов мышей в разные сроки исследования (усл.ед.)

*-данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05

Как видно, термолабильный энтеротоксин E.cloacae уменьшает число лизосом в перитонеальных макрофагах, что приводит к снижению их переваривающей способности.

Фагоцитоз сопряжен с наработкой активных форм кислорода (АФК) с последующим внутриклеточным киллингом патогена (А.А. Тотолян и др., 2000; И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001; Н.С. Олиферук и др., 2005). Наиболее доступным и часто используемым подходом для оценки активности кислородзависимых систем бактерицидности фагоцитов является НСТ? тест (спонтанный и индуцированный).

Так, исследование О2 - зависимого метаболизма фагоцитов в динамике показало активацию генерации АФК в 1 день и резкое снижение количества образования супероксиданиона в последующие дни исследования, особенно в клетках мышей I и III групп.

Показатели индуцированного латексом НСТ отражают резервные возможности фагоцитов к усиленной продукции АФК.

Установлено, что искусственная активация латексом приводит к снижению восстановления НСТ в клетках мышей, контактировавших с LT - энтеротоксином. Учитывая полученные результаты, можем констатировать факт о предельных возможностях работы ГМФШ-клеток под действием токсина, что, по-видимому, отражает недостаточность антиоксидантной системы фагоцитов, поскольку показатели количества образования свободных радикалов без индукции были намного выше. Близкие результаты были получены в работах Н.С. Олиферук и др. (2005), Ю.Н. Гончарук и др. (2006), Л.М. Сомовой и др. (2006). Результаты отражены в табл. 2.

Таблица 2. Динамика НСТ-редуцирующей способности перитонеальных макрофагов мышей в разные сроки исследования (М±m)

*-различия статистически достоверны в сравнении с группой контрольных животных ( р<0,05)

Таким образом, у мышей, инфицированных LT-энтеротоксином E.cloacae, нарушалась способность перитонеальных макрофагов к восстановлению НСТ, что отражает дефекты кислородзависимых механизмов бактерицидности.

Исход фагоцитарной реакции, где участвуют фагоциты и бактерийные патогены, далеко не всегда заканчивается в пользу фагоцита. В ряде ситуаций микробной клетке удается, несмотря на ее поглощение фагоцитом, избежать последующего киллинга, что связано с различными приемами, выработанными патогеном в процессе микроэволюции. Как показывают приведенные данные, важным инструментом такой защиты от фагоцитов является LT-энтеротоксин E.cloacae.

Заключительным этапом функции антигенпредставляющих клеток является представление и определение направленности иммунного ответа (А.А. Тотолян и др., 2000; С.Н. Теплова и др., 2002; А.П. Топтыгина, 2008).

Исследования показали, что в селезенке I и III группы мышей выработка антителообразующих клеток (АОК) снижается, что может зависеть от подавления антигенпроцессинговой и антигенпрезентирующей функций фагоцитов на этапе фагоцитарного звена иммунитета. Различия с контролем в группе экспериментальных животных были статистически значимы (р<0,001). Результаты представлены на рис. 8.

Рис. 8. Антигенпредставляющая функция перитонеальных макрофагов мышей в разные сроки исследования (АОК•102в селезенке)

*-данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05

Данный факт послужил основанием к расшифровке механизма иммунной супрессии и проведению дальнейших опытов, характеризующих Т- и В- звено иммунитета.

Важнейшим показателем влияния стимулирующего агента на иммунную систему является пролиферативная активность лимфоцитов.

В результате проведенных исследований установлено, что LT-энтеротоксин E.cloacae обладает трансформирующим эффектом на Т-лимфоциты мышей. Следует отметить, что спонтанная пролиферативная активность лимфоцитов была выше, чем при стимуляции ФГА и КонА. Результаты отражены на рис. 9 и 10.

Рис. 9. Индуцированная митогенами (КонА, ФГА) пролиферативная активность Т-лимфоцитов мышей в динамике (%)

* р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса

Рис.10. Спонтанная пролиферативная активность Т-лимфоцитов мышей в динамике (%)

* р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса

Как видно из рисунка, LT-энтеротоксин E.cloacae стимулирует митотическую активность Т-лимфоцитов, подтверждением чему явились показатели индекса стимуляции.

Гуморальный иммунный ответ является специфической Th-2-зависимой формой реакции на внедрение чужеродных антигенов. Эффекторное звено такого отклика - это антигенспецифичные иммуноглобулины (А.П. Топтыгина, 2008).

Иммунный ответ организма имеет некоторые отличия, когда в роли патогена выступают внеклеточные или внутриклеточные паразиты. Поскольку ведущая роль в антиинфекционной защите организма от внеклеточной группы паразитов преимущественно принадлежит нейтрофилам, иммуноглобулинам и комплементу, в то время как в элиминации вторых - решающую роль играют Т-лимфоциты и макрофаги, хотя механизмы межклеточных коопераций в обоих случаях тесно взаимосвязаны друг с другом.

В связи с этим нами были проведены серии опытов по определению числа антителообразующих клеток к эритроцитам барана в селезенке, характеризующих гуморальный иммунный ответ хозяина.

Результаты исследований представлены на рис.11.

Рис.11. Динамика количества АОК-ЭБ в селезенке мышей (АОК•102 в селезенке), усл.ед

*р<0,001по q-критерию Ньюмена-Кейлса;

**р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса

Как видно из рис.11, оценка В-звена иммунитета свидетельствует о снижении количества АОК в селезенке экспериментальных животных. Наиболее низкие показатели АОК отмечаются в I группе животных, зараженных LТ-энтеротоксином E.cloacae.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что LТ-энтертоксин E. сloacae угнетает иммунный ответ мышей на ЭБ.

Кроме микробицидной и цитотоксической функции генерация супероксиданионрадикала способствует и иммунорегуляторному действию активированных фагоцитов, в частности, секреции цитокинов. Было установлено, что супероксидный анионрадикал участвует в выработке хемотаксических пептидов и индукции синтеза IL-1-подобного фактора (H.Schmidt et al., 2004), этому также свидетельствует большой спектр секретируемых макрофагами интерлейкинов, имеющих отношение к регуляции иммунного ответа (И.В. Дуда и др., 1978; С.А. Кетлинский и др., 1995; М.И. Карсонова и др., 2007). Функциональная активность цитокинов определяет направление дифференцировки T - клеток в Th1/Tc1, Th2/Tc2 тип, а также определяет класс иммуноглобулинов, на продукцию которого переключаются В-клетки (И.Н. Швыдченко и др., 2005).

В связи с этим было изучено влияние LT-энтеротоксина E. cloacae на уровень провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-12, IFN-, TNF-), противовоспалительных цитокинов (TGF-, IL-10) и цитокинов, регулирующих специфические иммунные реакции (IL-2, IL - 4, IL - 15).

Изменения реактивности внутриклеточных механизмов макрофагов перитонеального экссудата подтвердили факт нарушения секреции интерлейкинов, регулирующих в последующем каскад иммуннологических реакций. В частности, в опытах по детекции посттранскрипционной экспрессии мРНК-интерлейкинов методом ПЦР с последующей амплификацией кДНК и дот-гибридизацией синтезированных ампликонов, удалось выявить существенные нарушения экспрессии отдельных цитокинов под влиянием LT-энтеротоксина E.cloacae.