Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
Иммунобиологические свойства термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия «патоген - хозяин»
03.02.03 - микробиология
14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология
доктора медицинских наук
Ахтариева Айгуль Атласовна
Челябинск 2010
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» и на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава».
Научные консультанты:
Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Габидуллин Зайнулла Гайнулинович;
Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Долгушин Илья Ильич.
Официальные оппоненты:
Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАН, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бухарин Олег Валерьевич;
доктор медицинских наук, профессор Бурмистрова Александра Леонидовна доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович.
Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов УроРАН, г. Пермь
Защита диссертации состоится ____________________2010 года в _______ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.117.03 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава».
Автореферат разослан « » 2010 года
Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор Л.Ф. Телешева.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
патогенность микроорганизм генетический энтеротоксин
Актуальность проблемы.
В настоящее время пристальное внимание уделяется проблеме инфекционных заболеваний, вызываемых условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ), патогенез которых недостаточно изучен. В развитии инфекционного процесса, ассоциируемого с УПЭ, безусловно, основополагающую роль играют токсины возбудителя, среди которых особый интерес представляет термолабильный (LT) энтеротоксин бактерий рода Enterobacter.
Известно, что LT-энтеротоксины УПЭ имеют сходный механизм токсического эффекта на желудочно-кишечный тракт как человека, так и животных, к разряду основных клинических проявлений которого относят диарейный симптомокомплекс на фоне выраженной интоксикации организма (A.L. Horstman, M.J. Kuehn, 2000; A.M. Al-Majali et al., 2000; C. Khursigara et al., 2001; M. Field, 2003; R. Mundy et al., 2005; J. Weckamp et al., 2005). Их местное воздействие способствует закреплению инфекта и повышает вероятность инвазии; они инициируют системные реaкции, достаточно удаленные от зоны первичной локализации (F. Qadri et al., 2005; P.A. Kenneth et al., 2006; D. Borenshtein et al., 2008; A. Masuda et al., 2008). Кроме того, выявлено, что LT-энтеротоксины УПЭ иммунологически схожи, в частности, определены сходства LT-энтеротоксинов E. cloacae и Escherichia coli (F.A. Klipstein, R.F.Engert, 1977; S.F. Jiwa et al., 1981; F. A. Klipstein et al., 1983; F. J. Pagotto et al., 2003; Hajishengallis G. et al., 2004; 2005). Вместе с тем, комплексный анализ иммунобиологических характеристик в системе «патоген-хозяин» LT- энтеротоксина Enterobacter spp. не проводился.
Течение любого инфекционного процесса тесным образом взаимосвязано с факторами и механизмами иммунной реактивности, поэтому понимание глубины патогенеза заболевания невозможно без раскрытия иммунологического контекста этой проблемы.
В преодолении защитной функции системы иммунореактивности при инфекционных процессах важную роль играют особенности реагирования клеточных факторов врожденного иммунитета в ответ на возбудителя. Одними из главных клеток врожденного иммунитета, осуществляющих первую линию защиты организма от инфекции, являются фагоциты - макрофаги, нейтрофилы, натуральные киллеры, дендритные клетки и др. (А. А. Тотолян, И.С. Фрейдлин, 2000; И.С. Фрейдлин, 2008; Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, 2008; И.И. Долгушин и др., 2009; S. Pasare, R. Medzhitov, 2005; M. Hausmann et al., 2005; O. Levy, 2005; C.B. Kenneth et al., 2006; A.N. Kopitar et al., 2006; S. Uematsu et al., 2006; A.J. Talati et al., 2008). В основе защитной функции указанных эффекторов лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности поглощать и уничтожать чужеродный материал (В.А. Ляшенко, 1995; C.A. Кетлинский, Н.М. Калинина, 1995; А. А. Тотолян, И.С. Фрейдлин, 2000; 2008; И.И. Долгушин и др., 2009; C.A. Jr. Janeway, R. Medzhitov, 2002).
Функциональные возможности фагоцитов могут меняться при действии разных объектов фагоцитоза (В.А. Ляшенко, 1995; И.И.Долгушин, О.В. Бухарин, 2001; М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин, 2006; Н.Г. Плехова, 2006; Б.В. Пинегин, А.Н. Маянский, 2007; Б.В. Пинегин, М.И. Кирсанов, 2009; A.Sing et al., 2000; M.G. Paraje et.al., 2005; Л.М. Сомова, 2006; А.Н. Ильинская и др., 2007; М.И. Карсонова и др., 2007; D. Heumann et al., 2006; S.C. Eisenbarth, R.A. Flavell, 2006; T. Kawai, S. Akira 2006; S. Park et al., 2009).
Кроме того, чрезмерное воспаление, сопровождающееся избыточной продукцией и секрецией агрессивных молекул и радикалов, может привести к массивным повреждениям клеток и тканей организма (G.A. Stunczuk et al., 2003; D. Borenshtein et al., 2008).
Процесс взаимодействия патогена с клеткой хозяина вызывает развитие каскада иммунологических реакций, сопровождающихся продукцией цитокинов, спектр секреции которых зависит не только от вида бактерий, но и от их факторов патогенности (A.C. Симбирцев, 2004; Л.В. Ковальчук и др., 2005; А.Н. Маянский и др., 2007; Л.В. Ковальчук и др., 2008; C. Meserli et al., 1981; P.L. Meroni et al., 1987; G. R. Comelis, F. Van Gijsegem, 2000; S.W. Chensue et al., 2001; E.R. Kandimalla et al., 2003; O. Levy, 2005; A.J. Talati et al., 2008). Бактерии, со своей стороны, также используют разные возможности манипулирования цитокинами для своей выгоды (О.В. Бухарин и др., 2005; D.S. Merrell, S.Folkow, 2004).
В настоящее время существуют убедительные доказательства о том, что клинический исход заболевания во многом зависит от баланса секреции про- и противовоспалительных медиаторов (G.A. Stunczuk et al., 2003; S. Xanthoulea et al., 2004; D. Borenshtein et al., 2008; G. Mateolli et al., 2008).
Современное понимание особенностей иммунной реакции при инфекционных заболеваниях, вызванных энтеротоксигенными УПЭ, в частности, бактериями рода Enterobacter, невозможно без оценки функциональной активности Т- и В-лимфоцитов, так как направление дифференцировки Т-клеток в Т-хелпер - 1 (Th1)/ Т-супрессор - 1 (Тс1) или Т-хелпер - 2 (Th2)/ Т-супрессор - 2 (Tc2) тип, переключение В-клеток на продукцию классов иммуноглобулинов определяет характер и течение заболевания (А.С. Симбирцев, 2002; И.Н. Швыдченко и др., 2005; Г.Ф. Железникова, 2006; А.П. Суслов и др., 2006; Е.Г. Пономарева и др., 2007; А.Н. Маянский и др., 2007; J.M.A. Klapproth et al., 2000; B.S. Feng et al., 2008).
В настоящее время внимание исследователей привлекают вопросы изучения апопотоза эукариотических клеток, поскольку многие патогенные микроорганизмы выработали совершенные механизмы управления гибелью клеток хозяина в целях выживания (J. Moss et al., 1980; W. X. Ding et al., 2000; C. Arce et al., 2005; N. Kamado et al., 2008.). Вместе с тем, нарушение процессов инициации и реализации летальной программы клеток иммунной системы часто становится основополагающей в определении характера и тяжести течения патологического процесса. Поэтому изучение влияния LT-энтеротоксина Enterobacter spp. на апоптоз клеток иммунной системы хозяина также является актуальным.
Исходя из вышеизложенного, представляет научный и практический интерес изучение характеристики иммунобиологических возможностей LT-энтеротоксина Enterobacter spp. и сопряженных с ним иммунных реакций организма. Полученные данные помогут глубже проникнуть в фундаментальные механизмы патогенеза инфекционных заболеваний, вызываемых энтеротоксигенными Enterobacter spp., и откроют новые возможности управления ими.
На наш взгляд, представления о взаимоотношениях между паразитом и хозяином можно расширить, изучив морфологические особенности Enterobacter spp., характеристику факторов патогенности и генетические детерминанты патогенности.
Цель исследования
Дать комплексную характеристику иммунобиологическим свойствам термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия “патоген-хозяин”.
Задачи исследования
Оценить фенотипические проявления факторов патогенности клинических штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с желудочно-кишечными, гнойно-воспалительными и урологическими инфекциями.
Провести комплексное тестирование биологических свойств клинических штаммов Enterobacter spp. и определить штаммы, обладающие факторами патогенности и являющиеся суперпродуцентами термолабильного энтеротоксина.
Изучить генотипическую характеристику «островков патогенности» Enterobacter spp., специфичных генам, входящим в состав патогенных кластеров E.coli и ответственных за разные этапы взаимодействия возбудителя с макроорганизмом.
Определить особенности иммунного реагирования на разных этапах взаимодействия энтеротоксигенных представителей рода Enterobacter в системе “патоген-хозяин”.
Изучить механизмы патогенного действия термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp. на этапах формирования иммунного ответа организма хозяина.
Определить влияние термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp. на апоптоз перитонеальных фагоцитов мышей.
Научная новизна
Из коллекции культур Enterobacter spp. были выделены новые 3 штамма, обладающие комплексом факторов патогенности, в частности, продуцирующие термолабильный энтеротоксин: Enterobacter gergoviae ГИСК №259 (патент РФ №2161197 от 18.11.1999), Enterobacter cloacae ГИСК №258 (патент РФ №2164942 от 13.03.2000), Enterobacter agglomerans ГИСК №257 (патент РФ №2162485 от 13.03.2000).
Впервые получены данные, характеризующие фенотипические особенности бактерий рода Enterobacter, коррелирующие с их патогенностью. Установлены различия между клетками Enterobacter spp., образующими центр колоний и имеющими размеры 1,97±0,12 мкм в длину и 0,72±0,18 мкм в ширину, и формирующими на периферии колонии так называемые «швермеры» (бродяги). Эти высокоподвижные длинные клетки имеют избыточное количество жгутиков. У высокоадгезивных штаммов Enterobacter spp. обнаружены по периметру реснички длиной 297,8±152,8 нм и шириной 4,91±0,53 нм.
Впервые проведена молекулярно-биологическая характеристика клинических штаммов Enterobacter spp. в свете новых представлений о генетических основах патогенности микроорганизмов: обнаружены гены, аналогичные с “островками патогенности” E.coli.
На основе комплексного системного анализа выявлены особенности изменения иммунной системы животных, включая оценку феномена апоптоза клеток воспалительного экссудата.
Впервые выявлен эффект иммуносупрессивного влияния термолабильного энтеротоксина на антигенпрезентирующую и процессинговую функции перитонеальных макрофагов, расшифрованы молекулярные механизмы подавления указанных функций у макрофагов, опосредованных ложной индукцией трансформирующего фактора роста-в (TGF-).
В патогенезе инфекционного процесса, связанного с термолабильным энтеротоксином, впервые определен характер модулирующего влияния токсина на макрофаги и нейтрофилы. Он способен несколько снижать продукцию интерферона-г (IFN-г). В то же время исследование состояния внутриклеточных механизмов микробиоцидной активности перитонеальных фагоцитов под влиянием термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp. выявило негативное действие токсина на активность ферментов гексозомонофосфатного шунта фагоцитов, что характеризовалось резким снижением образования супероксидных анионов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные экспериментальные данные дополняют и углубляют представления о молекулярных механизмах действия термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на иммунную систему хозяина, раскрывают патогенез инфекционных процессов, обусловленных токсинпродуцирующими штаммами энтеробактерий, и создают основу для разработки этиопатогенетических принципов лечения и целенаправленной профилактики инфекционных заболеваний. Полученные данные будут полезны для своевременной коррекции иммунологических нарушений, связанных с энтеротоксинпродуцирующими штаммами условно-патогенных энтеробактерий.
Установлены маркеры вирулентности у штаммов Enterobacter spp., что позволит разработать пути целенаправленной профилактики и лечения инфекционных заболеваний, вызванных бактериями рода Enterobacter.
Отработаны оптимальные подходы для выяснения этиологической значимости бактерий рода Enterobacter, выделенных от больных с желудочно-кишечными, гнойно-воспалительными и урологическими заболеваниями.
Результаты работы расширяют экспериментальную базу для изучения патологических процессов, происходящих при острой энтеробактерной инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Патогенетические возможности клинических штаммов Enterobacter spp. определяются их способностью к адгезии, продукции цитолизинов, токсинообразованию и персистентными свойствами.
2. Генотипическая характеристика «островков патогенности» бактерий рода Enterobacter детерминирована HlyA, HlyB, papAH, papC, sfaA, sfaG генами E.coli.
3. Бактерии рода Enterobacter, выделенные из очагов поражения, включают генетически разнородные варианты, что имеет ценность для эпидемиологической оценки.
4. Патогенетическое действие термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter связано с его действием на различные этапы формирования иммунного ответа хозяина, в первую очередь, на антигенпрезентирующую функцию перитонеальных макрофагов и продукцию ими цитокинов TGF-в, TNF-б и IFN-г.
Внедрение результатов исследования
Депонированные в ФГУН ГНИИСК имени Л.А. Тарасевича 3 штамма Enterobacter spp. (Патенты: №2161197 от 18.11.1999; №2164942 от 13.03.2000; №2162485 от 13.03.2000) используются в работе лаборатории анатоксинов «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ в качестве токсигенных тест - культур.
Результаты исследования используются в бактериологических лабораториях Детской Республиканской клинической больницы и Республиканской клинической больницы им. Г.Г. Куватова г.Уфы.