Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии; эпидемиологии и детских инфекционных болезней ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава»; на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО «ЧелГМА». Издано учебное пособие для врачей - бактериологов и клинических лаборантов «Условно-патогенные энтеробактерии» (Уфа, 2006; 2009).
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на VI конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2005); конференции «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтическое образование» (Уфа, 2006); конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека и прикладной иммунологии» (Челябинск, 2006); V Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006), Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука - 2007» (Уфа, 2007); IX съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука-2008» (Уфа, 2008); 73-й итоговой Республиканской Научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2008), X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2008), VII Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); обсуждены на совместном заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава», Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов и ведущих сотрудников уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ.
Публикации.
По теме диссертации опубликованы 45 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 227 страницах, иллюстрирована 31 таблицами и 28 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 95 отечественных и 320 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Клинический материал бактерий рода Enterobacter получали из бактериологических лабораторий Республиканской клинической больницы им. Куватова Г.Г., Городской клинической больницы №21, Детской Республиканской клинической больницы и Больницы скорой медицинской помощи №22 г. Уфы в период с 1998 по 2008 г.г.
В качестве эталонных штаммов использовали E.gergoviae ГИСК №259 (Патент РФ №2161197 от 18.11.1999), E.cloacae ГИСК №258 (Патент РФ №2164942 от 13.03.2000) и E.agglomerans ГИСК №257 (патент РФ №2162485 от 13.03.2000). В настоящее время Enterobacter agglomerans (Pantoeа agglomerans) выделен в новый род Pantoeа.
Эксперименты выполнены на 1130 беспородных белых мышах-самцах, 14 кроликах, 36 белых мышах - сосунках. Животные содержались в условиях вивария БГМУ с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96). Животные (мыши и кролики) получены из питомника лабораторных животных уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ и из питомника БГМУ.
В соответствии с целью диссертационной работы экспериментальная часть выполнялась в 3 этапа.
На первом этапе оценивались фенотипические признаки патогенности клинических штаммов Enterobacter spp. in vitro.
Объектом изучения служили 218 клинических штаммов бактерий рода Enterobacter, выделенных из проб клинического материала, полученного от больных с желудочно-кишечными, урологическими, гнойно-воспалительными заболеваниями - 132 штамма и здоровых лиц - 86 штаммов.
Биохимическую идентификацию культур осуществляли с использованием тест-систем «Enterotest» фирмы «Lachema» (Чехия) и компьютерной биохимической тест-системы типа API фирмы «BioMeruiox».
Изучение бактериальных колоний и особенностей клеточной структуры бактерий рода Enterobacter проводили с помощью оптического («Биолам», Россия) и электронного («JEM-100B», Япония) микроскопов.
Адгезивную активность изучали в реакции гемагглютинации с эритроцитами птиц (З.Г. Габидуллин и др., 1987) и I (0) группы АВО человека (В.И. Брилис и др., 1986). Продукцию б-гемолизина, тиолзависимого и энтерогемолизина определяли по рекомендациям Г.З. Габидуллина (1978), J. Albesa et al. (1985) и L. Beutin et al. (1988) соответственно. Определение лецитиназной активности проводили на желточном агаре Ю.Н. Чистовича (1961), антилизоцимную активность (АЛА) определяли по методу О.В. Бухарина и др. (1984), антиинтерфероновую активность (АИА) - по методу Ю.В. Соколова (1990), антикомплементарную активность (АКА) - по методу О.В. Бухарина (2000), ДНК-азную активность по C.D. Jeffries et al. (1957). Патогенность и вирулентность штаммов Enterobacter spp. оценивалась in vivo с определением протистоцидной активности на простейших - Paramecium caudatum (Х.Л. Галикеев, 1987), по способности вызывать гибель белых мышей (М.К.Войно-Ясенецкая, 1957), токсигенности бактериальных культур Enterobacter spp. на моделях лигированной петли тонкого кишечника кролика, на мышах-сосунках (R. Gianella et al., 1976) и в плантарном тесте (Ю.Н. Вартанян и др., 1978).
На втором этапе изучали генотипические признаки патогенности бактерий. Для этого выделяли бактериальную ДНК лизоцимом («Serva» США) с добавлением протеиназы, плазмидную ДНК по методу C.T. Каdо, S.T. Liu (1981), проводили избирательную амплификацию участков ДНК «островков патогенности» методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для амплификации использовали специфические праймеры, подобранные на определенные участки генов для E.coli и ответственные за разные этапы взаимодействия патогена с клеткой хозяина (А.Р. Мавзютов, 2001; E.F. Boyd, 1998).
На третьем этапе изучали патогенетические механизмы термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия «патоген-хозяин» in vivo.
Модель острой энтеробактерной экспериментальной инфекции воспроизводили в 3 экспериментальных группах:
- экспериментальная 1: осуществляли внутрибрюшинным введением бульонной культуры E.cloacae, содержащей LT-энтеротоксин в дозе LD50 -5 •1010КОЕ/мл.
- экспериментальная 2: осуществляли внутрибрюшинным введением бульонной культуры изогенной пары E.cloacae в дозе LD50-5 •106 КОЕ/мл.
- экспериментальная 3: осуществляли внутрибрюшинным введением супернатанта бульонной культуры E.cloacae в дозе LD50-5 •108 КОЕ/мл.
- контрольная: введение 0,9%-й физиологический раствор NaCl .
При введении дозы LD50 развивался инфекционный процесс, сопровождающийся выраженными изменениями активности животных, массы и состояния шерстяного покрова.
Оценку всех тестируемых параметров проводили на 1-е, 3-и, 5-е и15-е сутки.
Перитонеальные макрофаги (ПМ) мышей получали после внутрибрюшинного введения 2 мл пептонного бульона.
Селезенку после извлечения и взвешивания разрезали ножницами на несколько частей, размельчали в стеклянном гемогенизаторе Поттера и путем 2-3 тракций выдавливали клеточную массу в охлажденную среду 199.
Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколл - верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095 (L.Wong, 1975).
На третьем этапе проводили: 1)оценку способности ПМ поглощать частицы полистирольного латекса (И.С.Фрейдлин и др., 1976); 2)изучение антигенпрезентирующей и процессинговой функции перитонеальных макрофагов (В.Г. Галактонов, Т.В.Анфалова, 1974); 3)НСТ - тест (А.Н.Маянский, М.Е.Виксман, 1979); 4)изучение уровня суммарного свечения лизосом в цитоплазме ПМ (И.С.Фрейдлин, 1984); 5)определение числа антителообразующих клеток (N.K. Jerne, 1963); 6)определение интерлейкинов макрофагов и нейтрофилов воспалительного перитонеального экссудата методом ПЦР; ДНК-гибридизации с праймерами и ДНК-зондом, подобранным по M.Takano (1998); 7)исследование апоптоза клеток воспалительного перитонеального экссудата в проточном цитофлюориметре (FL3, >600 нм) по структурным изменениям ядерной ДНК клеток, окрашенных йодистым пропидием (С.В. Сибиряк и др., 2008).
Методы статистической обработки
Для анализа данных использовали методы описательной статистики и дисперсионного анализа. При сравнении 2-х групп применяли парный критерий Стьюдента для независимых выборок; для множественных сравнений-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони, тест Ньюмена - Кейлса и метод Крускала - Уоллиса. При сравнении результатов опытов с альтернативной формой реакции использовался точный критерий Фишера для четырехпольных таблиц. Для сравнения категориальных переменных проводился анализ таблиц сопряженности с использованием критерия ч2.
Для оценки степени (доли) влияния фактора проводился одно- и двухфакторный дисперсионный анализ, где были рассчитаны коэффициенты (з2) и уровень их статистической значимости. Отличия считали статистически значимыми при р<0,05 (И.П. Ашмарин, 1962; О.Ю. Реброва, 2002; В.М. Зайцев и др., 2006).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование проб клинического материала, полученного от больных с инфекционными процессами различной локализации, показали, что наиболее часто Enterobacter spp. обнаруживаются при желудочно-кишечных инфекциях - 49 шт. (39%) (рис.1).
Рис.1. Распределение штаммов Enterobacter spp. по источникам выделения (%)
По видовому составу из 218 клинических штаммов Enterobacter spp. 63 шт. (28,9%) относились к E.cloacae, 59 шт. (27,1%) - E.aerogenes, 52 (23,9%) - E.gergoviaе, 39 шт. (17,8%) - E.sakazakii и 5 шт. (2,3%) - E. agglomerans.
Среди бактерий рода Enterobacter подавляющее большинство культур (86,2%) составляли прототрофы, а 13,8% - ауксотрофы. При сравнительном анализе частоты встречаемости прототрофов в зависимости от источника выделения было установлено, что в испражнениях больных с желудочно-кишечной патологией прототрофы обнаруживаются в 87,7% случаев против 91,3% контроля (ч2=0,62; р=0,365), в моче больных урологическими инфекциями в 81,9% против 91,3% контроля (ч2=0,08, р=0,78) и в раневом отделяемом больных с гнойно-воспалительными процессами - в 82,1% случаев против 83,3% контроля (ч2 =0,001; р=0,996)
Полученные результаты свидетельствуют о высокой экологической пластичности указанных бактерий, что позволяет адаптироваться им в различных полостях организма хозяина.
Электронно-микроскопические исследования показали, что колонии Enterobacter spp. способны к клеточной специализации и многоклеточной организации. У бактерий хорошо заметны различия между вегетативными клетками, образующими центр колонии и имеющими размеры длиной 1,97±0,12 мкм и шириной 0,72±0,18 мкм, и локализованными на периферии колонии высокоподвижными длинными клетками - «швермерами» (бродягами), имеющими избыточное количество жгутиков, среднее число которых колеблется от 7 до 60.
Рис.2. Электронограмма снимков колоний бактерий Enterobacter spp
Электронограмма отпечатков колоний Enterobacter spp. убедительно показала наличие между клетками контактов двух типов: плотное слипание клеток между собой и контакты “конец в конец”.
По данным M.E.Bayer (1975), через липидные слои мембран проходят соприкасающиеся белковые структуры, часто называемые “Байеровскими зонами” (рис.2б). В результате соединения двух таких белковых структур образуется непрерывный водный канал, связывающий цитозоли двух взаимодействующих клеток. Это своего рода аналог примитивной “циркуляторной системы”, доставляющей питательные субстраты и убирающей продукты метаболизма (J.W. Costerton et al., 1995).
В колониях бактерий имеются перемычки, внутриплазматические мостики, поры и каналы (рис.2в), а также более специализированные структуры (“газовые баллоны”), окруженные своеобразной “мембраной” и содержащие внеклеточные гемопротеины. Предположительно, такие структуры способствуют транспорту О2 к клеткам в колониях (агрегатах) и являются аналогами дыхательной системы органов (В.И. Дуда и др., 1995).
В настоящее время сформировалась тенденция рассматривать межклеточные коммуникации у микроорганизмов с позиций кворума клеток в системе (О.В. Бухарин и др., 2005; К.Р. Allen et al., 2006; S. Towsend et al., 2006). Существующие сложные системы межклеточных контактов, способствуют распространению сигнальных молекул в популяции, особенно если речь идёт о недиффундирующих в среде факторах “коммуникации” (J.K. Crane et al., 1999). Вероятно, в эффектах кворума принимают участие все три канала коммуникации (химический, механический, опосредованный физическими полями), но наиболее изучена химическая сигнальная система, в которой внеклеточная концентрация ауторегуляторов отражает плотность микробных популяций. Например, показана способность штаммов E.sakazakii синтезировать сигнальные молекулы «чувства кворума» (quorum sensing), регулирующие экспрессию факторов патогенности. К ним относят молекулы N-гексаноил-L-гомосеринлактонов двух типов, выявленные методом тонкослойной хроматографии (A. Lehner et al., 2005; G.T. Gunduz, G. Tuncel, 2006).
Наличие определенных структур на внешней поверхности бактериальной клетки определяет их адгезивность к чувствительным клеткам хозяина, и обеспечивает быструю колонизацию самых разнообразных поверхностей, в том числе мембран клеток. Их фенотипическая экспрессия строго коррелирует с образованием пилей разных типов и обусловливает РГА (D.C. Old et al., 1983; 1984; Mange Jean-Philippe et al., 2006).