Анализ результатов показал, что из 218 клинических штаммов Enterobacter spp., 141 (64,7%) являются маннозочувствительными и 77 (35,3%) - маннозорезистентными.
При сравнительном анализе маннозорезистентных и маннозочувствительных клинических штаммов Enterobacter spp. в зависимости от источника выделения чаще обнаруживались маннозочувствительные штаммы Enterobacter spp. при гнойно-воспалительных процессах (87,2% против 29,2% в контроле; ч2=19,53; р=0,001).
В следующей серии опытов мы провели оценку адгезивной активности средний показатель адгезивности (СПА) штаммов Enterobacter spp. в реакции гемагглютинации с формалинизированными эритроцитами I (0) группы крови системы АВО.
Результаты исследования показали, что из 218 клинических штаммов Enterobacter spp. 132 (60,6%) обладали адгезивной активностью.
У штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с желудочно-кишечной патологией, адгезивные свойства встречались чаще и были выражены сильнее (рис.3).
Рис.3. Распределение показателей адгезивности клинических штаммов Enterobacter spp., выделенных у больных с патологией желудочно-кишечного тракта и в контрольной группе (%)
Результаты дисперсионного анализа показали, что коэффициент влияния экологического фактора на адгезивные свойства бактерий рода Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, составил з2=14,9% (F=22,9; р<0,01). Этому способствует наличие развитого аппарата адгезии, обеспечивающего способность бактерий выдерживать воздействие перистальтической волны или тока мочи (T.G. Theander et al., 1998).
Наименьшей экологической зависимостью обладали культуры Enterobacter spp., изолированные при урологической патологии (з2=9,1%; F=9,3; р<0,05), а у штаммов Enterobacter spp., выделенных при гнойно-воспалительных процессах, коэффициент влияния экологического фактора составил 14% (F=14,7; р<0,05).
Способность к адгезии, зависящей от условий экониш, позволяет расценивать адгезивность, как существенный детерминант, необходимый возбудителю для быстрого размножения и колонизации. Способность к адгезии обеспечивает выживаемость бактерий на разных этапах инфекционного процесса, особенно в начальной его фазе (T.G.Theander et al., 1998).
Изучение ультраструктуры внешней поверхности бактериальной клетки высокоадгезивных штаммов Enterobacter spp. показало наличие ресничек длиной 297,8±152,8 нм и шириной 4,91±0,53 нм.
Таким образом, адгезия бактерий рода Enterobacter spp. обусловлена наличием фимбриальных структур, с помощью которых происходит специфическое взаимодействие микроба с определенными рецепторами клеток хозяина.
В целях самосохранения бактериальные клетки обладают защитными механизмами дистанционного действия, которые благоприятствуют их выживанию. В этом отношении были изучены фенотипические признаки способности инактивировать лизоцим, лейкоцитарный интерферон и комплемент.
Фенотипический признак инактивации лизоцима был обнаружен у 87 (40%) клинических штаммов Enterobacter spp.
Штаммы АЛА были преимущественно представлены изолятами от больных с патологией желудочно-кишечного тракта - 33 (67,4%) против 3 (8,1%) контроля (ч2=12,33; р=0,001).
При этом результат дисперсионного анализа показал, что коэффициент влияния экологического фактора на АЛА штаммов Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, был слабым и составил з2=0,6% (F=3,5; р>0,05), а для штаммов Enterobacter spp., изолированных при гнойно-воспалительных процессах и урологических заболеваниях, был з2=24,6% (F=43,1; р<0,001) и з2=4,4% (F=7,5; р<0,05) соответственно. Таким образом, существенное влияние на АЛА Enterobacter spp, изолированных при гнойно-воспалительных процессах, оказывает экологический фактор.
АИА обладали 56 (25,7%) клинических штаммов Enterobacter spp.
Наибольшую способность инактивировать интерферон проявляли штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечной патологией - 22 (44,6%), против 3 (8,1%) контроля (ч2=6,79; р=0,009) и с гнойно-воспалительными процессами 22 (56,4%) против 4 (16,7%) (ч2=3,4; р=0,065). При этом в большей зависимости от экологических условий по указанному признаку находились штаммы Enterobacter spp., изолированные при гнойно-воспалительных процессах (з2=13,5%; F=15,3; р<0,001), а в меньшей - штаммы Enterobacter spp., выделенные при желудочно-кишечных заболеваниях (з2=5,2%; F=12,8; р<0,05).
АКА была определена у 65 (29,8%) культур Enterobacter spp. Распространенность и экспрессия АКА варьировали. Наибольшей активностью обладали штаммы Enterobacter spp, выделенные при желудочно-кишечных заболеваниях - 38 ( 77,6%), против 5 (13,5%) контроля (ч2=11,48; р=0,001). Значения признака распределились следующим образом: штаммы Enterobacter spp. с высокой активностью составили 15 (30,6%) против 0 контроля, со средней активностью ? 16 (32,7%) против 0 контроля, с низкой активностью - 7 (14,3%) против 5 (13,5%) контролей (ч2=0,05; р=0,82), не активные - 11 (22,4%) против 32 (86,5%) контролей (ч2=10,1; р=0,001).
При этом коэффициент влияния экологического фактора на АКА культур Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, составил з2 =20% (F=33; р<0,001).
Колонизация эпителиальных поверхностей бактериальными клетками параллельно сопровождается секрецией гемолизинов. Среди них наиболее известны б-гемолизин, тиолзависимый гемолизин и энтерогемолизин.
Из 218 клинических штаммов Enterobacter spp. 35 (16,1%) продуцировали б - гемолизин, 76 (34,9%) - тиолзависимый гемолизин и 20 (9,2%) - энтерогемолизин.
В зависимости от источника выделения штаммов Enterobacter spp. частота встречаемости б-гемолитической активности была различной и колебалась в широких пределах. Штаммы Enterobacter spp. с б-гемолитической активностью наиболее часто выделялись от больных с желудочно-кишечной патологией и составили 12 (24,5%) при 4 (10,8%) в контроле (р>0,11).
По степени активности преобладали штаммы с высокой активностью - 6 (12,3%) при 0 контроля. В контрольной группе обнаруживались штаммы Enterobacter spp. с низкой активностью - 4 (10,8%) и неактивные штаммы - 33 (89,2%) (рис.4).
Рис.4. Показатели б-гемолитической активности штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с желудочно-кишечной патологией и в контрольной группе (%): 1 - отсутствует, 2 - низкая активность, 3 - средняя активность и 4 - высокая активность
Среди штаммов Enterobacter spp., продуцирующих тиолзависимый гемолизин, преобладали культуры, изолированные при патологии желудочно-кишечного тракта, и составили 30 (61,3%) против 4 (10,8%) контроля (ч2=9,24; р=0,002). При этом штаммов с высокой активностью было 7 (14,3%), со средней - 11 (22,5%) и с низкой - 12 (25,5%), неактивные составили 19 (38,8%) против 37 (100%) контроля.
Аналогичные результаты были получены и при исследовании энтерогемолитической активности Enterobacter spp. Результаты согласуются с данными I. Beutin et al. (1988).
Проведенный сравнительный анализ гемолитической активности Enterobacter spp. выявил их своеобразие, по всей видимости, отражающее результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям среды экониш.
Итоги дисперсионного анализа показали, что коэффициент влияния экологического фактора на тиолзависимую активность Enterobacter spp. был выше, чем на б- и тиолзависимую гемолитическую активности. Данные влияния экологического фактора на тиолзависимую активность Enterobacter spp. представлены в табл. 1.
Таблица 1. Сила экологического влияния на тиолзависимую гемолитическую активность штаммов Enterobacter spp
|
Нозология |
Сила влияния фактора, з2 (%) |
F |
р |
|
|
Желудочно-кишечные заболевания |
16,5 |
35,5 |
р<0,001 |
|
|
Урологические заболевания |
5,1 |
8,1 |
р<0,001 |
|
|
Гнойно-воспалительные процессы |
11,4 |
13,8 |
р<0,001 |
Изучение лецитиназной и ДНК-азной активностей Enterobacter spp. показали, что 59 (27,1%) и 22 (10,1%) штаммов, соответственно, обладают указанными свойствами.
Наиболее высокими значениями ДНК-азной активности характеризовались штаммы Enterobacter spp., изолированные от больных с желудочно-кишечной патологией. При этом высокая активность отмечалась у 13 (26,5%) штаммов против 0 контроля, средняя - у 10 (20,4%) против 1 (2,7%) контроля (р=0,0171), низкая - у 7 (14,3%) против 3 (8,1%) контроля (р=0,377) и неактивными были ? 19 (38,8%) против 33 (89,2%) (ч2=4,63; р<0,001). Полученные результаты согласуются с данными Н.А. Поликарпова и др. (1990).
Результаты дисперсионного анализа показали, что коэффициент влияния экологического фактора на ДНК-азную активность штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с патологией желудочно-кишечного тракта, составил з2=11,8% (F=19,5; р<0,001), а штаммов Enterobacter spp., изолированных при гнойно-воспалительных процессах, - з2=2,5% (F=5; р<0,05). Существенно ниже оказался коэффициент влияния экологического фактора на ДНК-азную активность штаммов Enterobacter spp., изолированных при патологии мочевыделительной системы (з2=0,6%; F=1,2; р>0,05).
В зависимости от источника выделения, лецитиназная активность была выше среди культур Enterobacter spp., выделенных от больных с гнойно-воспалительными процессами. При этом культуры с высокой активностью составили 4 (10,3%) против 0 контроля, средней активностью - 3 (7,7%) против 0 контроля, низкой активностью - 2 (5,1%) против 0 контроля, неактивные - 30 (76,9%) против 24 (100%) контроля (р=0,013).
Изучение силы экологического влияния на лецитиназную активность Enterobacter spp. показало, что более подверженными экологической детерминации оказались штаммы Enterobacter spp., выделенные при патологии желудочно-кишечного тракта (з2=22%, F=24,8; р<0,001). Это, возможно, отражает результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям среды эндоэкониш.
Способность бактерий продуцировать токсин тесным образом связана с патогенетической значимостью возбудителя при развитии ряда инфекционных заболеваний. В литературе имеются сообщения об энтеротоксигенной способности Enterobacter spp. (И.Х. Мамоткулов и др., 1997), при этом исследования, направленные на выявление способности Enterobacter spp. вырабатывать токсины, немногочисленны и противоречивы (М.М. Баркус и др., 1986). Рутинным подходом к определению токсигенности и вирулентности служат биологические пробы, которые, однако, имеют ряд недостатков, связанных с необходимостью использования лабораторных животных, трудоемкостью, но, вместе с тем, достаточно полно отражают этиологическую значимость предполагаемого возбудителя. В связи с этим было проведено тестирование клинических штаммов Enterobacter spp. с использованием модели “плантарного теста” (Ю.Н. Вартанян и др., 1978), “интраназального инфицирования” беспородных белых мышей (М.К. Войно-Ясенецкая, 1957) и определение протистоцидной активности на токсигенность и вирулентность (Х.Л. Галикеев, 1987).
В результате постановки теста «отек лап» у мышей лишь 17 (7,8%) исследованных культур Enterobacter spp. давали положительный результат. Наибольшей активностью в этом тесте характеризовались 9 (18,4%) культур, выделенных от больных с желудочно-кишечными инфекциями. Показатели у культур Enterobacter spp., выделенных при урологических заболеваниях, были сопоставимы с результатами культур, изолированных при гнойно-воспалительных процессах, соответственно 4 (9,1%) и 4 (10,3%) (ч2=1,607; р=0,446). Ни один из штаммов Enterobacter spp., изолированных от здоровых людей, не вызывал появления визуально определяемой отечности лап.
Полученные результаты свидетельствуют о способности клинических штаммов Enterobacter spp. синтезировать термолабильное токсическое вещество, обусловливающее развитие “отека лапки” у белых мышей, что совпадает с вирулентностью, поэтому плантарный тест может быть использован в качестве биологической модели для выявления энтеротоксигенности бактерий рода Enterobacter.
Среди клинических штаммов Enterobacter spp., давших «отек лапки», центрифугат 3 штаммов оказался способным давать отек лапки мышей с разницей к интактной лапке до 80 мг. На основании полученных результатов 3 штамма Enterobacter spp. были депонированы в ФГУН ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича, как продуценты LТ-энтеротоксина (патент РФ №2161197 от 18.11.1999, патент РФ №2164942 от 13.03.2000, патент РФ №2162485 от 13.03.2000).
В следующей серии опытов для подтверждения способности клинических штаммов Enterobacter spp. продуцировать LТ-энтеротоксин мы использовали метод «лигированная петля тонкого кишечника кролика» (R. Gianella et al., 1997). Результат опыта определялся по способности центрифугата 20-часовых бульонных культур Enterobacter spp. при введении в просвет тонкого кишечника кролика вызывать накопление экссудата, с последующим измерением отношения V/L (объема экссудата к длине лигированного участка). За положительную реакцию принимали показатель V/L=1,0-1,2.
Было выявлено 20 (9,2,6%) культур Enterobacter spp., вызывающих накопление экссудата в просвете тонкого кишечника кролика. При этом наибольшей активностью обладали штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечной патологией - 9 (18,4%). Так, у 1 (8,2%) штамма Enterobacter spp. против 0 в контроле V/L = 1,1-1,3, у 5 (10,2%) штаммов против 0 контроля V/L = 1,2, у 3 (6,1%) штаммов против 0 в контроле V/L = 1,0 и неактивные ? 37 (75,5%) штаммов против 37 (100%) в контроле.
Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных при гнойных процессах, преобладали штаммы с V/L = 1,2. Так, 1 (2,7%) штамм против 0 контроля обладал V/L = 1,1-1,3; 3 (7,7%) штамма против 0 в контроле ?V/L = 1,2; 2 (5,1%) штамма против 0 контроля ?V/L = 1,0 и неактивные 33 (84,6%) штамма против 24 (100%) в контроле (р=0,151).