Штаммы Enterobacter spp., изолированные при патологии мочевыделительной системы, обладали наименьшей активностью. Так, 3 (6,8%) штамма против 0 контроля вызывали V/L = 1,2; 2 (4,6%) штамма против 0 контроля вызывали V/L = 1,0 и неактивными были 39 (88,6%) штаммов против 25 (100%) в контроле (р=0,074). Как показали результаты, ни один из штаммов, выделенных у лиц из группы контроля, указанным свойством не обладал.
Сила влияния экологического фактора на показатели V/L была низкой и не имела статистически значимых различий.
На легочной модели 54 (24,8%) клинических штамма Enterobacter spp. вызывали гибель экспериментальных мышей.
Патогенный потенциал был наиболее выражен среди культур, выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, поскольку больший процент указанных культур - 4 (8,2%) вызывал гибель животных в ранние сроки и 15 (30,8%) штаммов обусловливали летальную инфекцию. Среди культур Enterobacter spp., выделенных при заболеваниях мочевыделительной системы, 2 (4,6%) штамма вызывали раннюю гибель животных и 11 (25%) - летальную инфекцию. Штаммы Enterobacter spp., изолированные от больных с гнойно-воспалительными процессами, раннюю гибель животных обусловливали в 3-х (7,7%) случаях, а летальную инфекцию - в 4-х (10,2%). При этом показатели гибели в ранние сроки и летальной инфекции относительно штаммов Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, не имели статистически значимых различий и составили соответственно ч2=0,544; р=0,762 и ч2=5,318; р=0,070.
При определении силы влияния экологического фактора на показатели интраназального теста обнаружено, что штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечными заболеваниями и гнойно-воспалительными процессами, находились в одинаковой зависимости от условий обитания, где сила влияния экологического фактора составила соответственно 8,6% (F=16,8; р<0,001) и 8,6% (F=13,5; р<0,001).
Проведенные нами исследования на различных биологических моделях экспериментальной инфекции показали, что интраназальное заражение и плантарный тест требуют значительного количества экспериментальных животных, поэтому не всегда выполнимы в условиях бактериологической лаборатории.
Метод, предложенный для выявления степени патогенности дизентерийных палочек на модели P.caudatum, вполне применим и для выявления патогенности УПЭ. Это связанно с тем, что P.caudatum относятся к эукариотическим клеткам, и могут быть чувствительны к действию токсических субстанций бактерий.
На модели P.caudatum был выявлен 61 (27,9%) клинический штамм Enterobacter spp., вызывающий гибель простейших.
Наибольшей активностью в этом тесте характеризовались штаммы Enterobacter spp., выделенные при патологии желудочно-кишечного тракта. Так, 1 (2,1%) штамм Enterobacter spp. против 0 контроля вызывал гибель P.caudatum в течение 0,5-14 мин, 6 (12,3%) штаммов против 0 контроля - в течение 1,5-3,4 мин, 16 (32,7%) штаммов против 3 (8,1%) в контроле - в течение 3,5-5,5 с (ч2=3,80; р=0,008), неактивными были 24 (52,9%) против 34 (91,9%) штамма контролей (р<0,001). Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с патологией мочевыделительной системы, в течение 0,5-1,4 мин угнетали жизнедеятельность P.caudatum 4 (9,1%) штамма против 0 контроля, в течение 1,5-3,4 мин - 3 (6,8%) штамма против 0 контроля, в течение 3,5-5,5 мин - 7 (15,9%) штаммов против 6 (24%) контроля (ч2=0,256; р=0,613), неактивными были 30 (68,2%) штамма против 19 (76%) в контроле (ч2=0,17; р=0,680). Штаммы Enterobacter spp., изолированные от больных с гнойно-воспалительными процессами, характеризовались следующими значениями: 3 (7,7%) штамма против 0 контроля инактивировали P. caudatum в течение 0,5-1,4 мин, 4 (10,3%) штамма против 0 контроля - в течение 1,5-3,4 мин, 8 (20,5%) штаммов против 3 (12,5%) в контроле в течение 3,5-5,5 мин (р=0,193), неактивными были 24 (61,5%) штамма против 34 (87,5%) в контроле (р=0,003).
Гибель P.caudatum в ранние сроки вызывали культуры Enterobacter spp., одновременно показавшие высокую патогенность при интраназальном инфицировании мышей, а также продуцировавшие термолабильные токсические вещества, выявляемые в тесте «отек лап» на мышах.
Итоги дисперсионного анализа показали, что экологический фактор оказывал крайне слабое влияние на протистоцидный тест. Так, коэффициент влияния экологического фактора на протистоцидный тест штаммов Enterobacter spp., изолированных от больных с желудочно-кишечными заболеваниями, составил з2=0,2% (F=0,8; р<0,05), выделенных при урологических заболеваниях, - з2=0,8% (F=1,2; р<0,05), изолированных при гнойно-воспалительных процессах, - з2=2,9% (F=4,1; р<0,05).
Результаты исследований дают основание заключить, что время, в течение которого происходит гибель инфузорий, зависит от биологических свойств клинических штаммов Enterobacter spp., в частности, от их способности продуцировать токсические вещества, наличие которых у бактерий сочетается с их способностью вызывать гибель интраназально зараженных мышей. Протистоцидный тест на P.caudatum может быть рекомендован для выявления потенциально патогенных клинических штаммов Enterobacter spp.
Таким образом, изолируемые при инфекционных процессах различной локализации штаммы Enterobacter spp. характеризуются свойствами, определяющими их потенциальную способность выживать в условиях внутренней среды макроорганизма благодаря возможности противостоять факторам врожденного иммунитета.
Известно, что фенотипические проявления экспрессируемого фактора патогенности заложены в геноме бактериальной клетки. При этом гены, определяющие патогенность, могут входить в состав как хромосомы, так и плазмиды, а также могут быть фланкированы в состав IS-последовательностей и транспозонов.
В связи с этим перспективным является исследование плазмидного профиля ДНК для генотипической характеристики клинических штаммов бактерий рода Enterobacter. Наличие в бактериальной клетке плазмидной ДНК дает микроорганизму широкие адаптационные возможности в различных экологических нишах. Планируя проведение соответствующих опытов, мы основывались на том, что плазмиды различаются на: кодирующие устойчивость к лекарственным препаратам - R-плазмиды; отвечающие за фертильность бактериальной клетки - F-плазмиды, а также плазмиды бактериоциногении и патогенности. Вирулентные свойства энтеробактерий, чаще всего, контролируются плазмидой патогенности. В частности, F-, R-плазмиды и плазмиды бактериоциногении могут включать tox+-транспозоны, кодирующие токсинообразование. Нередко tox+-плазмиды кодируют синтез интактных протоксинов, активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом (В.М. Бондаренко и др., 2001; А.Р. Мавзютов, 2002).
Анализ полученных данных позволил отобрать 132 клинических штаммов Enterobacter spp., обладающих Д-маннозочувствительной и Д-маннозорезистентной гемагглютинирующей активностью. Из 132 культур энтеробактеров 45 штаммов несли плазмиды, что составило 34,1%. При сравнительном анализе частоты встречаемости плазмидонесущих штаммов было установлено, что в 19 (42,2%) случаях относительно контроля плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно-кишечной патологией (ч2=4,95; р=0,03), в 16 (35,6%) - урологической патологией (ч2=3,46;р=0,06), в 7 (15,6%) - гнойно-воспалительными процессами (ч2=0,10; р=0,75) и 3 (6,6%) - от здоровых людей.
Молекулярные массы плазмид значительно различались. Так, электрофоретически было установлено, что бактерии рода Enterobacter, вне зависимости от источника выделения, могут нести плазмиды с массами 120; 60; 38; 3,2; 1,4 МД и другие. При изучении плазмидного профиля штаммов с высокой адгезивностью было установлено, что они вообще не имели внехромосомной ДНК.
В следующей серии опытов у штаммов с адгезивной активностью провели элиминирование плазмид в бульоне Хоттингера, содержащем 5% додецилсульфата натрия. Тестирование изогенных пар на их способность давать MS- и MR-реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка показало, что штаммы в одинаковой степени агглютинируют эритроциты. Результаты исследований дают основание полагать, что генетической детерминантой, контролирующей MS и MR реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка у Enterobacter spp., являются структурные элементы хромосомной природы.
Известно, что продукция LТ-энтеротоксина у E.coli детерминируется Ent плазмидами с мол.м. 55 - 61 МД (P.K. Lee et al.,1991; F.Qadri et al., 2005). В то же время энтеротоксин Vibrio cholerae является иммунологически родственным LT-энтеротоксину E.coli и C.freundii, контролируется структурными элементами хромосомной природы (M.I. Lesseva et al., 1995).
Из 17 культур энтеробактеров, продуцирующих LT-энтеротоксин, 13 штаммов оказались плазмидонесущими. В 8 случаях плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно - кишечной патологией, в 2 с урологической патологией, в 3 - гнойно-воспалительными процессами. Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от здоровых людей, LT-энтеротоксин продуцирующих штаммов не оказалось.
В связи с этим было проведено электрофоретическое исследование штаммов Enterobacter spp., продуцирующих LТ-энтеротоксин, на предмет обнаружения внехромосомных факторов наследственности. Для этого были выделены 2 группы штаммов: первую группу составили штаммы Enterobacter spp., суперпродуценты LT-энтеротоксина, способные вызывать “отек лап” мышей с разницей между контрольной лапкой 95 мг и более, вторую - культуры, не продуцирующие LT-энтеротоксин и дающие в опытах “отек лапки” разницу не более 35 мг. Все изученные 12 штаммов первой группы являлись носителями плазмиды мол.м. 60 МД. Среди 3 штаммов второй группы 2 культуры были бесплазмидными и 1 штамм нес плазмиды с мол.м.120; 38; 3,2 МД.
Элиминирование плазмид у штаммов, продуцирующих LT-энтеротоксин, показало, что бесплазмидные изогенные пары токсигенных штаммов не вызывали гибель P.caudatum.
Из 10 отобранных клонов каждого штамма Enterobacter spp., утративших свойство продуцировать LT-энтеротоксин, у двух на фореграмме просматривалась плазмида мол.м. 60 МД, остальные клоны оказались не несущими данной плазмиды и в биологических пробах не обладали активностью.
Опыты по фенотипическому определению гемолитической активности Enterobacter spp. указывают на то, что гемолизины являются одним из ведущих факторов патогенности клинических штаммов Enterobacter spp. В связи с этим было проведено электрофоретическое исследование гемолитически активных штаммов Enterobacter spp. для обнаружения природы детерминант.
Из 35 культур Enterobacter spp., способных гемолизировать эритроциты, 21 (60%) несли плазмиду мол.м. 120 МД. В 8 случаях плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно-кишечной патологией, в 5 - урологической патологией, в 6 - гнойно-воспалительными процессами и в 2 - здоровых людей. Различия в частоте обнаружения указанных плазмид относительно контроля носили статистически не значимый характер (р>0,05).
Полученные результаты, таким образом, говорили в пользу плазмидной природы детерминирования гемолитической активности штаммов Enterobacter spp. Существование бесплазмидных вариантов гемолитических энтеробактеров не исключало этого предположения, так как при этом на результатах могло сказаться небольшое число копий этих плазмид, которые не обнаруживались исследуемым методом.
Для проверки этой рабочей гипотезы путем обработки акридиновым оранжевым были получены 2 генетически родственные изогенные пары штаммов Enterobacter spp., различающихся по наличию плазмиды с молекулярной массой 120 МД. При этом клоны 2 штаммов не продуцировали ?гемолизин, а клоны 2 штаммов - продолжали его продуцировать.
Эти данные, по нашему мнению, свидетельствуют в пользу хромосомной природы детерминирования указанного признака. Установление этого факта представляется существенным и, по нашему мнению, заслуживает самостоятельного изучения.
Проведенные нами опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и конъюгативной передачи плазмид не привели к выявлению новых плазмид, контролирующих синтез энтерогемолизина, ДНК-азную, лецитиназную, антилизоцимную и антиинтерфероновую активности клинических штаммов Enterobacter spp.
Следует отметить, что сила влияния экологического фактора во всех исследованиях была низкой и варьировала от 1 до 2,5 % (р>0,05).
Таким образом, результаты изучения плазмидного профиля дают основание полагать, что генетической детерминантой адгезивной активности бактерий рода Enterobacter, возможно, являются структурные элементы хромосомной природы, продукции LT-энтеротоксина ? плазмида мол.м. 60 МД, ?гемолизина - 120 МД.
Наличие у ряда клинических штаммов Enterobacter spp. генетических детерминант, контролирующих факторы патогенности, свидетельствует о том, что среди культур Enterobacter spp. встречаются штаммы, которые следует рассматривать не как условно-патогенные, а как конкретные патовары бактерий рода Enterobacter.
Учитывая, что штаммы легко могут терять плазмиду с утратой, соответственно, фенотипического признака, мы провели серию опытов по их конъюгативной передаче от доноров реципиентам. Причем реципиентами были представители как одного рода, так и других, в том числе был использован универсальный реципиент E.coli K12 G62 Rif. В качестве доноров служили штаммы Enterobacter spp., имеющие плазмиды мол.м.м. 60 и 120 МД с выраженными фенотипическими признаками синтезировать высокоактивный LT-энтеротоксин и -гемолизин, соответственно. Опыты по скрещиванию родственных и неродственных представителей Enterobacteriaceae показали, что tox+ плазмида Enterobacter spp. может конъюгативно передаваться внутри рода Enterobacter, что объясняет трансформацию нетоксигенного реципиента в токсигенный патовар. Тогда как опыты по конъюгативной передаче tox+ плазмиды между неродственными представителями Enterobacteriaceae не увенчались успехом. Hly+ плазмида конъюгативно не перемещалась между штаммами, и это, на наш взгляд, может быть обусловлено большой мол.м. плазмиды (120 МД) или сложностью создания соответствующих условий для “интимных” процессов, либо же она является неконъюгативной.