В первой серии опытов мы изучали секрецию провоспалительных цитокинов, в частности, IL-6, IL-12, IFN- и TNF-б.
Результаты экспериментов показали, что транскрипция мРНК IL - 6 в клетках отмечается лишь на 3-и сутки. Так, радиографические сигналы наблюдались в клетках нейтрофилов контрольной и I группы животных, тогда как макрофаги сигнализировали их только у животных II группы.
IL - 6 повышает бактерицидность нейтрофилов без достоверных изменений показателей фагоцитоза, так как действует в постактивационный период жизни гранулоцита, запуская внутриклеточные механизмы бактериолиза и продлевая жизнь гранулоцита. IL - 6 в синергизме с IL-2 участвует также в активации и индукции пролиферации Т-лимфоцитов, является индуктором синтеза острофазных белков (А.А.Тотолян, 2000).
В экспериментах IL-12 транскрибировался в клетках макрофагов и нейтрофилов во всех группах животных как на 1-е сутки, так и на 15-е сутки исследования.
Транскрипция TNF-б отмечалась слабо на 5-е сутки исследования, как в опытных, так и в контрольной группе животных. У нейтрофилов сигнализировала радиографическая метка в контроле, а в макрофагах - только в опытных группах животных.
Существенные изменения наблюдались в транскрипции мРНК IFN-. Установлено, что транскрипция мРНК в нейтрофилах III группы животных происходила во все сроки исследования, но пик транскрипции мРНК приходился на 5-е сутки. В I группе животных радиометка сигнализировала только в 1-й день исследования. В остальных группах мышей радиографического сигнала не наблюдалось.
В макрофагах I группы животных экспрессия IFN- наблюдалась на 1-е сутки опытов и указывала на раннюю, возможно, ложную стимуляцию, поскольку в последующие дни экспериментов сигнала радиографической метки не наблюдалось. В I и II группах животных интенсивность радиографического сигнала усиливалась на 3- и сутки. В контрольной группе мышей транскрипция мРНК IFN- не обнаружена.
В следующей серии экспериментов была изучена транскрипция мРНК TGF- и IL-10.
Отличия в транскрипции мРНК отмечались в TGF-в. Как показали исследования, экспрессия TGF-в определялась макрофагальными клетками только в 1-е сутки опытов в I группе мышей. В контрольной группе животных наблюдались слабые сигналы.
В экспериментах транскрипция мРНК IL-2, IL-4 и IL-10 как у макрофагов, так и у нейтрофилов, не наблюдалась. Однако, важная роль в дифференцировке клеточного и гуморального типа иммунного ответа хозяина принадлежит именно IL-2 и IL-4 (S. Pasare, R. Medzhitov, 2004).
Изучение экспрессии мРНК IL-15 показало появление радиографического сигнала во всех изучаемых группах мышей на 1-й день опытов, как в нейтрофилах, так и в макрофагах. При этом интенсивность радиографического сигнала в макрофагах была выше в контроле и в I группе мышей.
Следует отметить, что, по литературным данным, IL-15 вырабатывается только макрофагами и по своему действию близок к IL-2. При участии IL-15 осуществляется пролиферация активированных Т-клеток и дифференцировка цитотоксических Т-лимфоцитов, а также активация NK-клеток (A.J. Talati et al., 2008), что противоречит полученным нами результатам. Таким образом, можно заключить, что LT-энтеротоксин E.cloacae, способствуя повышенной экспрессии TGF-в, подавляет в целом иммунологические реакции организма хозяина. Ранняя ложная индукция экспрессии IFN- макрофагами, возможно, имеет иммунокомпрометирующее значение, поскольку IFN- обладает плейотропным действием. Отсутствие в нейтрофилах транскрипции мРНК ключевых цитокинов указывает на то, что они как бы выключаются из цитокиновой регуляции иммунного ответа в инфекционном процессе. Макрофаги определяют первую линию защиты организма и испытывают на себе влияние факторов как бактериальной природы, так и образующихся в процессе иммунного ответа, причем патогены способны индуцировать их апоптоз.
Представления о спектре механизмов бактерийного выживания при инфекции в последнее время расширились за счет установления способности микробных патогенов регулировать процесс апоптоза. В условиях инфекционной патологии обычно апоптоз выполняет функцию защиты макроорганизма, где гибель инфицированных клеток с последующей их элиминацией из организма предотвращает распространение инфекции. Однако некоторые патогены, в частности, облигатные внутриклеточные паразиты в условиях инфицированного организма «отменяют» клеточную гибель, поддерживая жизнь клеток хозяина, тем самым способствуя собственному выживанию и персистенции (D.W. McGee et al., 1992; S. Mathias et al., 1993; C.S. Reise et al., 1999).
В связи с этим, представлялось целесообразным изучить влияние LT-энтеротоксина E.cloacae на программированную клеточную гибель клеток хозяина. Цитометрический анализ клеток перитонеального экссудата (КПЭ) с использованием двух видов светорассеяния (малого и под углом 90 С) показал, что КПЭ содержит две основные субпопуляции клеток, различающихся размерами и гранулярностью цитоплазмы.
Результаты исследования представлены на рис.12.
Рис.12. Уровень апоптоза клеток перитонеального экссудата мышей в динамике (усл.ед.)
*р<0,001 по q-критерию Ньюмена-Кейлса;
**р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса
Из рис. 12 видно, что во всех опытных группах отмечается появление апоптотических клеток. Однако, статистически достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались только в I группе мышей. Установлено, что в I группе мышей, зараженной LТ-энтеротоксином E.cloacae, количество ушедших в апоптоз клеток было значительно больше по сравнению с другими опытными группами. При этом количество апоптотических клеток в указанных группах были сопоставимы с показателями контрольной группы.
Данные B. Yankelevich и др. (1997) свидетельствуют о факте запуска программированной смерти CD4+ лимфоцитов, индуцируемого Ext В фрагментом термолабильного энтеротоксина E.coli и CD8+-холерогеном.
Таким образом, результаты изучения апоптоза клеток перитонеального экссудата, показывают, что термолабильный энтеротоксин E.cloacae может влиять на процесс апоптоза клеток перитонеального экссудата мышей.
Обобщая полученные результаты, можно заключить, что LT-энтеротоксин Enterobacter spp. является важным фактором патогенности, определяющим особенность развития инфекционного заболевания. Мишенями для его действия являются иммунокомпетентные клетки. Характеристика термолабильного энтеротоксина создает основу для разработки рациональных подходов в диагностике и лечении патологий, вызванных энтеротоксигенными Enterobacter spp.
ВЫВОДЫ
1. Штаммы бактерий рода Enterobacter, выделенные при инфекционно-воспалительной патологии желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы и гнойно-воспалительных процессах различной локализации, фенотипически характеризуются свойствами патогенности (способностью к адгезии, продукции цитолизинов, токсинообразованию и персистентными свойствами).
2. Колониальная организация микроорганизмов Enterobacter spp. характеризуется морфологической гетерогенностью, входящих в её состав клеток: обнаружены активно делящиеся формы с образованием клеточных кластеров; покоящиеся; спонтанно аутолизирующиеся клетки. В концентрических зонах колоний микробы преимущественно представлены клетками, образующими «швермеры», с избыточным количеством жгутиков, не способных к делению. Адгезивная активность бактерий рода Enterobacter обусловлена наличием ресничек длиной 297,8±152,8 нм и шириной 4,91±0,53 нм, способных агглютинировать эритроциты птиц.
3. Выявление у бактерий рода Enterobacter генетических фрагментов, определяющих их патогенность и токсигенность, идентичных с генами, входящими в состав “островков патогенности” E.coli, свидетельствует о едином генетическом механизме изменения патогенности и токсигенности.
4. В основе патогенетического механизма инфекционных процессов, обусловленных энтеротоксинпродуцирующими штаммами бактерий рода Enterobacter, лежит иммуносупрессивное действие термолабильного энтеротоксина на антигенпрезентирующую и антигенпроцессинговую функцию макрофагов, которое отражается на развитии иммунных реакций как алло-, так и аутогенных антигенов снижением числа антителообразующих клеток.
5. Механизм супрессивного действия термолабильного энтеротоксина может быть связан с ложной индукцией трансформирующего ростового фактора- макрофагами перитонеального экссудата, основная функция которого заключается в подавлении пролиферативной активности антигенспецифических клеток. Термолабильный энтеротоксин нарушает экспрессию интерферона- макрофагами и нейтрофилами, что может оказывать иммунокомпрометирующее плейотропное действие на развитие иммунных реакций хозяина.
6. Термолабильный энтеротоксин Enterobacter spp. нарушает функцию ферментов гексозо-монофосфатного шунта фагоцитов, что проявляется снижением образования супероксиданионов, с последующим уменьшением микробиоцидной функции макрофагов и нейтрофилов.
7. Термолабильный энтеротоксин Enterobacter spp. усиливает реакцию бласттрансформации лимфоцитов, в основе которой лежит нарушение проницаемости лизосомальных мембран, характеризующееся “опустошением” лизосомальных гранул клеток.
8. В результате действия энтеротоксинпродуцирующего штамма Enterobacter spp. прекращется транскрипция мРНК фактора некроза опухоли-б нейтрофилами. Это явление может служить причиной дизрегуляции запрограммированной клеточной смерти под влиянием фактора некроза опухоли-б, секретируемого нейтрофилами.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Штаммы Enterobacter gergoviae ГИСК №259, Enterobacter cloacae ГИСК №258, Enterobacter agglomerans ГИСК №257 рекомендуется использовать в качестве эталонных культур при идентификации выделенных штаммов от больных и в биотехнологии в качестве суперпродуцентов термолабильного энтеротоксина.
2.Для установления этиологической значимости Enterobacter spp. при патологиях желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы и гнойно-воспалительных процессах рекомендуется определение их факторов патогенности.
3.Для расшифровки инфекций, вызванных УПЭ, а также бактериями рода Enterobacter, рекомендуется определение генетических маркеров патогенности: HlyA, HlyB, papAH, papC, sfaA, sfa G.
4.Знания об иммуномодулирующих свойствах термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp., рекомендуется использовать при подборе лечебно-профилактических препаратов в терапии инфекций, вызванных токсигенными условно-патогенными энтеробактериями, в частности, бактериями рода Enterobacter.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. О некоторых биологических свойствах бактерий рода Еnterobacter Текст А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Д.Т. Гашимова, А.Р. Мавзютов // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: материалы второй международной конференции, посвященной 75-летию института им. Пастера. - СПб., 1998. ? С. 124.
2. Об антибиотикорезистентности бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Д.Т. Гашимова, А.Р. Мавзютов // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. ? С. 13.
3. Ахтариева, А.А. К вопросу о патогенном потенциале бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, Д.Т. Гашимова, М.М. Туйгунов // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. - С. 13.
4. Ахтариева, А.А Продукция энтеробактерами энтеротоксина [Текст] / А.А. Ахтариева, Д.Т. Гашимова, М.М. Туйгунов // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. - С. 13.
5. Ахтариева А.А. Адгезивная способность бактерий рода Enterobacter Текст А.А. Ахтариева, А.А. Камалова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. - С. 13.
6. Пат. №2161197 Рос. Федерация Штамм бактерий Enterobacter gergoviae ГИСК №259, обладающий комплексом факторов патогенности / А.А. Ахтариева, М.М. Алсынбаев, З.Г. Габидуллин, Р.Х. Хананова, А.К. Булгаков, В.Ф, Кулагин, Р.З. Суфиярова, Ю.З. Габидуллин, М.М, Гафаров, Р.А. Очилова (Российская Федерация). - №99124328; заявл. 18.11.1999, опубл. 27.12.2000, Бюл. №36. - 6с.
7. Пат. №2162485 Рос. Федерация Штамм бактерий Enterobacter agglomerans ГИСК №257, обладающий комплексом факторов патогенности / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, М.М. Алсынбаев, В.Ф. Кулагин, О.В. Кунягина, В.В. Ленгесова, А.А.Гарифуллин, А.Р. Мавзютов, М.М. Гафаров, Р.С. Суфияров, Д.Т. Гашимова (Российская Федерация). - №2000106136; заявл. 13.03.2000, опубл. 27.01.2001, Бюл. №3. - 6с.
8. Пат. №2164942 Рос. Федерация Штамм бактерий Enterobacter cloacae ГИСК №258, обладающий комплексом факторов патогенности / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, М.М. Алсынбаев, В.Ф. Кулагин, В.В. Ленгесова, Р.Х. Хананова, А.К. Булгаков, А.А.Гарифуллин, Ю.З. Габидуллин, Р.З. Суфиярова,А.Б. Бакиров (Российская Федерация). - №2000106268; заявл. 13.03.2000, опубл. 10.04.2001, Бюл. №10. - 6с.
9. Некоторые биологические свойства бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, В.В. Ленгесова, Р.К. Хананова, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин // Дерматовенерологической службе Республики Башкортостан - 80 лет: сборник трудов Республиканской конференции. - Уфа, 2000. ? С. 67?68.
10. Ахтариева, А.А. Ауксо- и прототрофность бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, А.А. Камалова, А.Н. Ишмухаметова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов 65?й юбилейной научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2000. ? Т. 1. - С. 16.
11. Ахтариева, А.А. Антилизоцимная и антиинтерфероновая активность бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, А.А. Камалова, А.Н. Ишмухаметова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов 65?й юбилейной научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2000. ? Т. 1. - С. 16?17.
12. Ахтариева, А.А. Гемолитическая активность бактерий рода Enterobacter Текст А.А. Ахтариева, А.А. Камалова, А.Н. Ишмухаметова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов 65?й юбилейной научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2000. ? Т. 1. - С. 17.