Материал: Барам_Курс лекций ВЭЖХ для ВСЕХ [2007]
ВЭЖХ - 2006 |
ХРОМАТОГРАФИЯИОНОВ |
|
|
|||||
|
|
|
||||||
|
НАОБРАЩЕНОЙФАЗЕ |
|
|
|||||
|
Слабые кислоты и основания |
|
|
|||||
R −COOH R −COO− + H + |
R − N +H3 R − NH2 + H + |
|||||||
Ka = |
[R −COO− ] [H + ] |
K |
a |
= |
[R − NH2 ] [H + ] |
|||
[R − COOH ] |
[R − N |
+H3 |
] |
|||||
|
|
|
||||||
|
R-COOH |
|
|
R-NH2 |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|||
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
R-NH3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
k' |
|
|
|
|
|
|
|
|
рКа |
|
|
R-COO |
|
|
||
|
рН раствора |
|
|
|
|
|
|
|
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
|
|
|
СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ"С18" |
|
|||||||
|
химическая дериватизация |
|
|
|||||
Производные аминокислот:
с фенилизотиоцианатом (ФТК-АК)
H S H COOH
N C N C R
H
с орто-фталевым альдегидом (ОФА-АК)
S CH2CH2OH
COOH
N C R
H
40
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
|
СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18" |
||||||
Порядок элюирования производных аминокислот |
||||||
из колонок с обращенной фазой |
|
|||||
Аминокислота |
Код |
Структура радикала R |
ФТК-АК |
ОФА-АК |
||
Аспарагиновая кислота |
Asp |
−CH2COO− |
1 |
1 |
||
Глутаминовая кислота |
Glu |
−CH2CH2COO− |
2 |
2 |
||
Серин |
Ser |
−CH2OH |
|
3 |
3 |
|
Глицин |
Gly |
−H |
|
4 |
7 |
|
Гистидин |
His |
NH |
5 |
4 |
||
CH2 |
|
|||||
Треонин |
Thr |
N |
|
6 |
6 |
|
−CHOHCH3 |
||||||
Аланин |
Ala |
−CH3 |
|
7 |
9 |
|
Аргинин |
Arg |
CH2 (CH2)2 N |
C NH |
8 |
5 |
|
H NH2 |
||||||
|
|
|
|
|||
Тирозин |
Tyr |
CH2 |
OH |
9 |
8 |
|
Валин |
Val |
−CH(CH3)2 |
10 |
11 |
||
Метионин |
Met |
−CH2CH2−SCH3 |
11 |
10 |
||
Изолейцин |
Ile |
−CHCH3CH2CH3 |
12 |
13 |
||
Лейцин |
Leu |
−CH2CH(CH3)2 |
13 |
14 |
||
Фенилаланин |
Phe |
CH2 |
|
14 |
12 |
|
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
|
|
|
|
СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18" |
||||||
Предсказание удерживания сложных молекул: пептиды |
||||||
N-конец |
|
|
Пептидная связь |
|
|
|
|
|
С-конец |
||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
O |
|
H |
|
|
|
|
O |
|
H |
||||||||||||||||
H2N |
|
|
CH |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
... |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
C |
|
N |
|
|
CH |
|
|
|
CH |
|
C |
|
N |
|
CH |
|
COOH |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
R1 |
|
|
|
|
R2 |
|
R3 |
|
|
|
|
R4 |
||||||||||||||||
Остатки аминокислот
VR f(Zi, V0)
Zi - вклад i-того структурного элемента пептида в его удерживание
41
ВЭЖХ - 2006
СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18"
Предсказание удерживания пептидов
Структурный |
Код |
Объем, |
|
||
элемент пептида |
мкл |
|
|||
|
|
VR |
Zi |
|
|
Asn |
N |
162 |
0 |
|
|
Ser |
S |
164 |
0 |
|
|
Asp |
D |
164 |
0 |
|
|
Gln |
Q |
165 |
0 |
|
|
Gly |
G |
170 |
5 |
|
|
His |
H |
175 |
10 |
|
|
Glu |
E |
177 |
12 |
мкл |
|
Thr |
T |
180 |
15 |
||
Lys |
K |
182 |
17 |
||
выч.), |
|||||
Cys |
C |
244 |
79 |
||
Ala |
A |
183 |
18 |
|
|
|
|
|
|
R |
|
Arg |
R |
196 |
31 |
||
|
|
|
|
( |
|
|
|
|
|
V |
|
Pro |
P |
215 |
50 |
||
|
|||||
Val |
V |
309 |
144 |
|
|
Met |
M |
354 |
189 |
|
|
Tyr |
Y |
512 |
347 |
|
|
Ile |
I |
643 |
478 |
|
|
Leu |
L |
686 |
521 |
|
|
Phe |
F |
811 |
646 |
|
|
Trp |
W |
1029 |
864 |
|
|
[(-СOOH) + (-NH2)]end |
CN |
- |
15 |
|
|
VR = 209 · [(Σ Zi) + ZCN + V0]1/3 - 990
3000
30 пептидов
2500
2000
1500
1000
500
0
0 |
500 |
1000 |
1500 |
2000 |
2500 |
3000 |
VR (эксп.), мкл
Азарова И.Н., Барам Г.И., Гольдберг Е.Л. Биоорган. химия, 2005, впечати
ВЭЖХ - 2006
СЕЛЕКТИВНОСТЬФАЗЫ "С18"
Предсказание удерживания пептидов
Оптическоепоглощение
Вычислено |
6 |
24 |
|
||
|
|
А210 |
|
|
|
|
|
А220 |
|
|
18 |
|
|
|
|
|
|
|
|
А230 |
|
21 |
|
|
|
А280 |
13 |
27 |
|
2 |
|
|
|||
4 |
5 |
|
|
|
|
|
|
|
30 |
||
|
|
|
|
|
|
Эксперимент |
|
21 |
|
||
|
|
|
6 |
|
24 |
|
|
|
|
|
|
|
|
5 |
13 |
18 |
27 |
|
4 |
|
|||
2 |
|
|
|
|
|
30
0 |
400 |
800 |
1200 |
1600 |
2000 |
2400 |
2800 |
Объем, мкл
Азарова И.Н., Барам Г.И., Гольдберг Е.Л. Биоорган. химия, 2005, впечати
42
ВЭЖХ - 2006
ХРОМАТОГРАФИЯИОНОВ
НАОБРАЩЕННОЙФАЗЕ
Ион-парная хроматография
|
|
|
|
|
_ |
O |
|
|
H3N+R |
|
|
O C R |
|
O |
|
|
CH3 |
_ |
O |
|
|
H2N+(R)2 |
|
||||
|
|
|
||||
S |
O- |
HN+(R)3 |
|
N+ CH3 |
O P O R |
|
O |
|
N+(R)4 |
|
CH3 |
|
O |
|
|
_ |
O |
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
O S R |
|
|
|
|
|
|
|
O |
|
КОНКУРЕНТЫ |
|
|
|
|
|
+ |
|
|
+ |
+ |
Ионообменный |
|
|
Катионы |
|
механизм |
|||
|
|
|
||||
|
|
Анионы |
|
|
|
|
+ |
|
|
+ |
+ |
Гидрофобный |
|
Гидрофобные |
|
механизм |
||||
молекулы
43
Лекция 4
Неподвижные фазы для колоночной жидкостной
хроматографии
Г.И.Барам Курс лекций "ВЭЖХ для ВСЕХ"
Новосибирск, 2007
44