Материал: 1010-pochvovedenie-2013-7

комнатной температуре, поскольку показано, что различия в ферментативной активности между раз$ ными почвами сохраняется при их высушивании [3]. Подобная стабильность относительных пока$ зателей характерна и для некоторых других мик$ робиологических свойств [20]. Вместе с тем, могут возникнуть справедливые сомнения в возможности получения достоверной информации об абсолют$ ных показателях при изучении комплекса лабиль$ ных свойств почвы при работе с образцами, высу$ шенными перед проведением анализов.

Вероятно, воздействие высушивания на ла$ бильные свойства в разных почвах может прояв$ ляться в разной степени. Так, почвы, подвергаю$ щиеся значительному иссушению в природных условиях, могут слабее реагировать на их высу$ шивание перед проведением анализов. В почвах же, постоянно находящихся во влажном состоя$ нии, лабильные свойства при высушивании мо$ гут меняться в большей степени. Примером почв, функционирующих в условиях высокой влажно$ сти и отсутствия периодов иссушения, являются горно$луговые почвы Северо$Западного Кавказа (в наиболее сухие периоды влажность гумусового горизонта этих почв не опускается ниже 40–50%). Однако из$за удаленности высокогорных объек$ тов от аналитических лабораторий, затрудняю$ щей быструю транспортировку образцов при низ$ кой температуре, при анализе этих почв (в том числе, ранее в наших исследованиях) зачастую использовались предварительно высушенные об$ разцы [1, 6, 21, 22].

Целью данной работы было изучение влияние высушивания образцов горно$луговых альпий$ ских почв на концентрации лабильных форм N и C и на активности микробной трансформации соединений этих элементов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования послужили образцы гумусовых горизонтов горно$луговых альпийских почв, взятых с глубины 0–10 см в двух биогеоце$ нозах, различающихся по экологическим услови$ ям формирования, видовому составу и продук$ тивности – альпийской лишайниковой пустоши (АЛП) и гераниево$копеечникового луга (ГКЛ). Детальное описание этих сообществ и почв при$ ведено в ранее опубликованных работах [2, 5, 7, 8, 25]. Исследуемые почвы характеризуются высо$ ким содержанием органического вещества и N, но отличаются по кислотности, содержанию N$

NH4+, активности процессов минерализации ор$ ганических соединений, нитрификации и по не$ которым другим показателям биологической ак$ тивности [1, 4, 6, 21].

В работе использовали четыре почвенных об$ разца – по два из почвы каждого биогеоценоза.

Два образца были высушены до воздушно$сухого состояния и хранились при комнатной темпера$ туре около четырех месяцев. Два других образца представляли условно естественное состояние (после отбора хранились около 10 дней в поли$ этиленовых пакетах при +4°С).

В основе работы лежит лабораторный инкуба$ ционный эксперимент с изотопной меткой 15N с целью получения более полных данных по мик$ робной трансформации лабильных соединений азота. Из каждого образца почвы, просеянной че$ рез сито 2 мм, брали 54 пробы (из расчета 6 г сухой почвы), в 18 из которых перед началом инкубации добавляли изотопную метку 15N в составе 15NH4Cl (98% 15N), в другие 18 – в составе 2$13C,15N$гли$ цина (98% 15N) и в 18 проб метку не добавляли. Изотоп 15N был добавлен в количестве 2.5 мкг N/г почвы, что позволяет считать удобрительный эф$ фект незначительным. Свежие образцы инкуби$ ровали при полевой влажности (69% для почвы АЛП и 55% для почвы ГКЛ), а сухие перед инку$ бированием предварительно увлажняли до такого же состояния. Инкубирование проводили в кли$ матической камере SANYO MIR$153 при температуре +15°С в течение 15 суток. Через 1, 8 и 15 суток после начала инкубации анализирова$ ли по 6 проб из каждого варианта эксперимента. Результаты, полученные в первый срок, рассмат$ ривали в качестве характеристики исходного со$ стояния почв и использовали для расчетов даль$ нейших процессов минерализации и микробной иммобилизации N и C.

Из трех проб экстрагировали лабильные со$ единения N и С с использованием 0.05 M K2SO4 при взбалтывании в течение 1 часа и соотноше$ нии почва/раствор = 1/5. В экстрактах определя$

+

ли концентрации N$NH4 , N$NO3−, общее содер$ жание N (N экстр) и C орг. Концентрацию N орг рассчитывали по разности между концентрация$

ми N экстр и неорганических форм азота (N$NH4+ +

+ N$NO3−). Из трех других проб аналогичную экс$ тракцию проводили после их фумигации парами хлороформа, стабилизированного амиленом, в течение суток в эксикаторе под разряжением, со$ здаваемым вакуумным насосом. В экстрактах определяли концентрации N экстр и С орг. N микр и C микр рассчитывали как разницу кон$ центраций N экстр и С орг в фумигированных и нефумигированных образцах [12, 31], то есть не использовали коэффициенты пересчета хлоро$ форм$лабильных форм N и С в N микр и C микр.

Неорганические формы N определяли коло$ риметрически на спектрофотометре Genesys

10 UV. Для определения N$NH4+ использовали са$ лицилат$нитропрусидный метод [17], а N$NO3−

определяли восстановлением до NO2− на кадмие$

вой колонке с последующим получением окра$ шенного азосоединения при реакции с сульфа$ ниламином и N$(1$нафтил)$этилендиамин$ди$ гидрохлоридом [13]. Концентрации N экстр и C орг определяли на автоматическом анализаторе TOC$VCPN. Изотопный состав N исследовали во

фракциях N$NH4+ и N экстр в нефумигированных образцах и во фракции N экстр в фумигирован$ ных образцах. Определение проводили на масс$ спектрометре DeltaPlus, после предварительного сжигания подготовленных к анализу проб на ав$ томатическом анализаторе Carlo Erba NC 2500.

Подготовка фракций к изотопному анализу за$ ключалась в концентрировании N и переводе его из растворенной в 0.05 М K2SO4 формы в твердую

фазу. N$NH4+ концентрировали методом диффу$ зии аммиака в щелочной среде и улавливали на кислотной ловушке [16]. Для этого от 1 до 10 мл

экстракта, содержащих от 20 до 60 мкг N$NH4+, помещали в полипропиленовые баночки объе$ мом 100 мл и выравнивали объем раствора до 50 мл, добавляя 0.05 М K2SO4. Если в 10 мл экс$

тракта содержалось менее 20 мкг N$NH4+, то перед процедурой диффузии аммиака в нее добавляли 40 мкг N$NH4Cl с известным изотопным соста$

вом азота (δ15N = –1.24‰) для того, чтобы со$ здать необходимое для последующего анализа ко$ личество элемента.

В каждую баночку с раствором помещали кис$ лотную ловушку и добавляли 150–200 мг MgO. Затем баночки быстро закрывали завинчивающи$ мися крышками, переворачивали вверх дном и взбалтывали на орбитальном шейкере при ком$

натной температуре в течение семи суток. После этого вынимали кислотные ловушки, обмывали их дистиллированной водой, подсушивали между двумя слоями фильтровальной бумаги и помеща$ ли для сушки на 5–6 дней в эксикатор, содержа$ щий силикагель и открытый стаканчик с концен$ трированной серной кислотой. Высушенный фильтр извлекали из кислотной ловушки и ис$ пользовали в качестве образца для определения изотопного состава N$NH4.

Для изготовления кислотной ловушки стек$ лянный фильтр диаметром 9 мм, смоченный 20 мкл 2.5 М KHSO4, помещали в двухслойную упаковку из тефлоновой ленты шириной 2.5 см и склеивали ее сдавливанием по кругу открытым концом стеклянной пробирки диаметром 2 см.

N экстр концентрировали, выпаривая 10 мл экстракта в фарфоровой чашке на водяной бане при 60°С. Если концентрация N в экстракте была менее 10 мкг/мл, то перед выпариванием к образ$ цу добавляли 200 мкг N$NH4Cl (δ15N = –1.24‰). Выпаренные соли гомогенизировали металличе$ ским шпателем и растирали фарфоровым пести$ ком. Для изотопного анализа использовали 10– 20 мг соли, в которых содержалось 20–60 мкг N.

Атомный процент 15N орг рассчитывали мето$ дом изотопного баланса (уравнение (1)), исходя

+

из изотопного состава N экстр и N$NH4 (N$NO3− не учитывали ввиду низкой концентрации), а при расчете атомного процента 15N микр использова$ ли данные изотопного состава N экстр в нефуми$ гированных и в фумигированных образцах (урав$ нение (2)):

Обогащение соединений N изотопом 15N оце$ нивали относительно контрольного варианта эксперимента (без добавления 15N), и на этой ос$ нове рассчитывали распределение внесенного в почву изотопа 15N (в %) между разными фракци$ ями азота (N$NH4, N орг, N микр) на разных эта$ пах инкубирования образцов.

На основании полученных данных были рас$ считаны активности нетто$процессов минерали$ зации органических соединений N, нитрифика$ ции и микробной иммобилизации C и N для раз$ ных этапов инкубационного эксперимента, как разница конечных и исходных концентраций

+

N$NH4 + N$NO3−, N$NO3−, N микр и С микр соот$ ветственно. Активности гросс$минерализации

органических соединений N (уравнение (5)), учи$ тывающей микробную иммобилизацию образую$ щегося при минерализации аммонийного азота, и гросс$иммобилизации (уравнение (6)) рассчита$ ны методом разбавления изотопной метки [18]:

где m – гросс$минерализация (мг/кг N в сутки), i – гросс$иммобилизация (мг/кг N в сутки), H0 –

масса изотопа 15N (мг/кг) в момент времени t = 0, M0 – суммарная масса N (мг/кг) в момент време$

ни t = 0, H – масса изотопа 15N (мг/кг) в момент времени t = t, M – суммарная масса N (мг/кг) в момент времени t = t, t – продолжительность ин$ кубации (в сутках).

Авторы приведенных формул рекомендуют использовать их при инкубации почв не более се$ ми суток, предполагая, что за это время не проис$ ходит существенной реминерализации N микр. Поэтому мы рассчитывали гросс$минерализацию только для первой половины инкубационного эксперимента.

Для всех результатов, полученных на каждом этапе эксперимента в трехкратной повторности, рассчитаны средние значения и оценена значи$ мость их различий по t$критерию.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как и ожидалось, внесение в почву изотопной метки 15N не оказало удобрительного эффекта (добавление ни минеральной соли, ни аминокис$ лоты не привело к статистически значимому из$ менению концентраций лабильных форм N и C и активностей процессов их микробной трансфор$ мации). Поэтому при характеристике содержания лабильных форм N и C и их трансформации ис$ пользовали средние показатели из всех трех вари$

антов эксперимента, и для них оценивали досто$ верность различия по t$критерию.

С о д е р ж а н и е л а б и л ь н ы х ф о р м а з о т а и у г л е р о д а. Для исследованных почв при сохранении условий естественного увлажне$ ния отобранных образцов характерны очень низ$

+

кие концентрации N$NO3−, преобладание N$NH4 в составе неорганических соединений N и близ$

кое содержание экстрагируемых форм N$NH4+ и N орг. Концентрация N микр на порядок превы$

шает количество N$NH4+ и N орг. Такое же превы$ шение характерно для С микр над С орг. При этом две изученные почвы различаются по содержа$ нию лабильных форм N и C. Концентрации всех изученных фракций в почве ГКЛ в 2.0–3.7 раза выше, чем в почве АЛП. Соотношения С/N в экс$ трагируемом органическом веществе и в микроб$ ной биомассе почвы АЛП несколько более высо$ кие, что говорит о меньшей обогащенности азо$ том этих фракций (табл. 1).

Высушивание образцов почв сильно изменяет

+

их свойства. Так, концентрации N$NO3−, N$NH4 , N орг и C орг увеличились в почвах АЛП и ГКЛ примерно в 5 раз, в то время как количество эле$ ментов в составе микробной биомассы уменьши$ лось в 2–3 раза. Увеличение содержания неорга$ нических форм N при высушивании почв наблю$ далось ранее и другими авторами, свидетельствуя об активной минерализации органических соеди$ нений N [11, 32]. Одновременное резкое увеличе$ ние концентраций N орг и C орг и уменьшение N микр и С микр объясняется гибелью микроор$ ганизмов и экстракцией N и С из лизировавших$ ся клеток [24].

Наблюдается неплохое соответствие между уменьшением концентраций N микр и С микр и увеличением концентраций экстрагируемых эле$ ментов немикробных фракций. Так, концентра$ ция N микр при высушивании почв АЛП и ГКЛ уменьшилась на 43 и 113 мг/кг соответственно, а сумма концентраций экстрагируемых немикроб$ ных форм N увеличилась на 35 и 95 мг/кг. Непло$ хое соответствие наблюдается также между уменьшением концентрации С микр и увеличе$ нием С орг (соответствующие изменения в почве АЛП составили 331 и 264 мг/кг, а в почве ГКЛ – 868 и 552 мг/кг). Это дает основание считать, что именно микробная биомасса явилась источни$ ком дополнительного количества других экстра$ гируемых форм N и С при высушивании образцов горно$луговых почв. При этом соотношение не$ органических и органической форм N в суммар$ ном приросте концентрации N экстр различалось в почвах АЛП и ГКЛ, свидетельствуя о разной ак$ тивности минерализации. Так, в почве АЛП, ха$ рактеризующейся меньшей активностью минера$ лизации N органических соединений [6],

Показатель

АЛП

15$й день

1.3 (0.4 )*

47 (5 )

0.05 (0.03 )

0.9 (0.1 )*

8.4 (0.7 )*

9 (2 )*

76 (5 )

46 (4 )

55 (6 )

170 (19 )

613 (54 )

369 (48 )

7.1 (0.3 )*

18.9 (0.9 )*

8.2 (1.2 )

8.0 (1.0 )

–0.15 (0.06 )

0.7 (0.5 )*

–0.004 (0.004 )

0.07 (0.02 )*

0.5(0.7 )

1.0 (0.6 )

–0.9 (0.5 )

4 (1 )*

Не опр.

»

8$й день

11.4 (0.7 )

137(7 )*

0.24(0.06 )*

1.4 (0.2 )*

12 (2 )

25 (5 )*

186 (24 )

79 (4 )*

133 (11 )

307 (15 )*

1231 (35 )

542 (28 )*

11.1 (0.7 )

12.3 (0.5 )

6.6 (0.5 )

6.8 (0.3 )

0.1 (0.1 )

11 (2 )

0.02 (0.01 )

0.12(0.03 )

1.6 (1.1 )

2.4 (0.5 )

–2.7 (1.9 )

20 (7 )

2.4 (0.9 )

8 (3 )

2.0 (0.9 )

2.7 (0.9 )

ГКЛ

15$й день

14.2 (0.9 )*

162 (8 )*

1.0 (0.2 )*

5.6 (0.9 )*

17 (2 )*

19 (4 )

201 (10 )

89 (17 )

165 (12 )*

264 (18 )*

1345 (41 )*

531 (40 )

9.7 (0.2 )

13.9 (0.6 )*

6.7 (0.3 )

6.0 (0.9 )

0.4 (0.2 )*

3.6 (0.9 )*

0.10 (0.03 )*

0.6 (0.2 )*

2.1 (1.9 )

1.4 (0.3 )*

16 (9 )*

1.6 (0.9 )*

Не опр.

»

лизация и гросс$иммобилизация N составляли около 1 мг/кг в сутки (табл. 2). Об активном по$ треблении N микроорганизмами свидетельствует и то, что почти весь внесенный в почву 15N (2.5 мг/кг) был иммобилизован в течение первых же суток (рисунок).

При инкубации образцов почвы ГКЛ изменения концентраций лабильных фракций N и C были бо$ лее выражены. Достоверные изменения концентра$

ций (увеличение) характерны для N$NO3− (в течение

всей инкубации), N$NH4+, N орг, C орг и C микр (во второй половине эксперимента) (табл. 1, 2).

Таким образом, для почвы ГКЛ в отличие от поч$ вы АЛП характерны положительные значения нетто$минерализации и нитрификации, и актив$ ности этих процессов увеличивались в ходе инку$ бации. Абсолютные значения иммобилизации N также оказались более высокими, но при отсут$ ствии статистически значимых изменений кон$ центрации N микр этот показатель едва ли можно считать информативным. Активности гросс$про$ цессов, как и в почве АЛП, были значительно большими и составили около 2 мг/кг в сутки. Та$ ким образом, инкубация свежих образцов почв АЛП и ГКЛ подтвердила их существенные отли$