6. Варианты основных методов |
41 |
Рис. 17. Микрофотография среза островковой клетки поджелудочной ж еле зы крысы. Д ля локализации инсулина и С-пептида проводили двойное ок рашивание с использованием меченных золотом антител. Ультратонкий срез обрабатывали одновременно антителами к инсулину, полученными в мор ских свинках, и кроличьими антителами к С-пептиду (для локализации предшественника инсулина). Второй слой представлял собой смесь козьих антител к IgG морской свинки, конъюгированных с частицами золота ди аметром 20 нм, и козьих антител к IgG кролика, конъюгированных с час тицами золота диаметром 5 нм. Обратите внимание на то, что в области гранул сконцентрированы обе метки. Подготовка ткани: ткань высушивали из замороженного состояния при очень низкой температуре, фиксировали парами тетраокиси осмия и заливали в аралдит. После окрашивания анти телами срез докрасили уранилацетатом и цитратом свинца. Ткань была подготовлена д-ром Р. В. Дудеком, Университет штата Северная Каролина, Северная Каролина, США.
ся для окраш ивания при помощи антител. |
Н иже приводится |
|||
описание метода, в основе |
которого леж ит |
образование ави- |
||
дин-биотинового комплекса |
(АБК) . (Подробно см. в работах |
|||
G uesdon |
et al., 1979; Hsu, Raine, 1981; H su |
et al., 1981; |
Childs, |
|
U nabia, |
1982). |
|
|
|
Первый слой — кроличьи |
антитела к исследуемому |
антиге |
||
ну. Второй слой — биотинилированные козьи антитела к кро личьим IgG . Третий слой — комплекс авидина с биотинилированной пероксидазой. При образовании этого комплекса не обходимо смешивать компоненты в таком соотношении, что-
42 |
6. Варианты основных |
методов |
|
|
Комплекс авидина с |
лЙпВгл |
|
|
биотинилированной |
||
|
пероксидазой |
V |
J i U n L V |
|
|
||
|
Вторые антитела, |
|
Загрязняющие антитела в'ыходят |
меченные биотином |
|
||
|
|
|
из реакции за счет разведения |
Блокирование |
Блокирование авидин- |
неспецифического |
связывающих участков |
связывания неиммунной |
комплексом авидина |
сывороткой |
с немеченым биотином |
Рис. 18. Метод авидин-биотинового комплекса |
(АБК). |
бы часть биотин-связывающих участков молекулы авидина была бы не занята биотинилированной пероксидазой и могла бы взаимодействовать с биотином, присоединенным к антите
лам второго слоя. Затем пероксидазу |
проявляют Д А Б или |
||
другим методом (рис. 18). |
Очевидно, |
что в |
этом случае к |
каждой точке, содержащ ей |
антиген, |
будет |
присоединено |
очень много молекул пероксидазы. Данный метод можно при менять такж е и для электронно-микроскопических исследова ний; при этом используют обычный набор электроноплотных меток.
Разработаны методы, позволяющие избежать неж елатель
ного связывания |
авидина |
с биотином, присутствующим в т а |
||||
ких тканях, как |
печень и |
почки (Wood, W arnke, 1981). |
Д ля |
|||
блокирования |
ткань обрабатываю т |
свободным |
авидином, |
ко |
||
торый затем |
насыщают биотином. |
Н а каждой |
молекуле |
био |
||
тина имеется только один авидин-связывающий участок, и, следовательно, связывание меченного пероксидазой биотинавидинового комплекса с тканью исключается.
6.6. Пектины
Ещ е один метод выявления компонентов ткани основан на применении меченных ферментами, золотом или флуоресцент ными красителями лектинов. Строго говоря, его нельзя на звать иммуноцитохимическим, так как он не включает ис пользование антител. Лектины — это растительные белки, которые связываю тся с тканевыми компонентами, главным образом гликопротеинами с высокой степенью специфичности
(Roth, 1978; Ponder, 1983).
7.СПЕЦИФИЧНОСТЬ РЕАКЦИИ
ИОСНОВНЫЕ КОНТРОЛИ
Д ля того чтобы убедиться в достоверности положительно го результата, полученного при помощи иммуноцитохимических методов, необходимо исключить возможность неспеци фических реакций (табл. 3 и 4).
Таблица 3. Основные контроли
Контролы на реактивы
1.В каждом эксперименте необходимо проводить окрашивание заведомо положительной ткани
2. Проверка окрашивания, |
полученного |
на исследуемой ткани: |
|
а) |
в качестве первого слоя наносят неиммунную сыворотку; |
||
б) |
сыворотку, заведомо |
не взаимодействующую с тканью; |
|
в) первый слой опускают |
|
||
Результаты окрашивания |
должны быть |
отрицательными |
|
Контроли на специфичность антисыворотки
3. Антитела (в максимальном разведении, дающем хорошее окрашивание) предварительно адсорбируют специфическим антигеном (0,1— 10 нмоль/ /мл)
Результаты окрашивания должны быть отрицательными
4.Антитела в том же разведении, что указано в п. 3, преадсорбируют дру гим антигеном
Результаты окрашивания должны быть положительными
5.Антитела в том же разведении, что указано в п. 3, адсорбируют фраг ментами специфического или близкого по структуре антигена
Результаты эксперимента помогут установить молекулярную структуру окрашиваемого вещества и выявить фрагменты антигена, с которыми вза имодействуют антитела
7.1.Неспецифичность сыворотки
Возможные причины неспецифичности:
1. Гетерогенность популяции антител в сыворотке донора обусловливает взаимодействие не только с исследуемым ан
тигеном, |
но и с другими компонентами ткани. |
|
2 . Несколько родственных веществ (особенно это касается |
||
пептидов) |
имеют |
общие аминокислотные последовательности, |
в результате чего |
антитела реагируют с несколькими анти |
|
генами вместо одного.
44 7. Специфичность реакции и основные контроли
Таблица 4. Неспецифическое окрашивание: методические трудности и пути их преодоления
Непрямой иммунофлуоресцентный метод
Методические
трудности
Сильная фоновая флуоресценция
Фоновая |
(эндоген |
||
ная) |
пероксидазная |
||
активность, |
или |
«не |
|
специфическое» |
окра |
||
шивание |
лейкоцитов |
||
и эритроцитов |
|
||
Перекрестная реак ция одного препарата антител с разными антигенами
Пути преодоления
1.Использовать более высокие разведения пер вых и/или вторых антител
2.До нанесения первых антител провести блоки рование нормальной сывороткой животного, донора вторых антител
3.Удалить свободный флуоресцеинизоцианат с помощью хроматографии на колонке с сефадек-
сом G-50
4.Провести адсорбцию первых и вторых антител альбумином или порошком ткани животного того вида, ткань которого окрашивают
Пероксидазный и ПАП-методы
1.Использовать более высокие разведения пер вых и/или вторых антител
2.До нанесения первых антител провести блоки рование более концентрированной (вплоть до неразведенной) сывороткой животного, донора вторых антител; провести блокирование нор мальной сывороткой и после нанесения первых антител, до добавления вторых. Внести в бу фер, используемый для промывки, детергент
(тритон Х-100, 0,2%) для снижения неспецифи ческого связывания белка
3. Попытаться как можно сильнее заблокировать эндогенную пероксидазу, например 0,3% Н 2Ог в буфере, метаноле или этаноле; нитроферрицианидом натрия (1% раствор в метаноле, со держащем 1 % уксусной кислоты); смесью периодат/борогидрид
4.Проявлять пероксидазу по методу Хэнкера— Иейтса, который, как утверждают, выявляет только растительную пероксидазу (в данном случае пероксидазу из хрена)
5.Провести адсорбцию первых антител альбуми ном или тканевым порошком
6.Провести аффинную очистку первых антител (при этом может понизиться авидность)
7.Удалить комплемент из препарата первых ан тител путем добавления постороннего комплек са антиген—антитело или прогревая антисыво
ротку в течение 30 мин при 56°С
8.Вместо пероксидазы использовать систему ще лочной фосфатазы (эндогенный фермент блоки руют инкубацией в 20% уксусной кислоте)
1.Проверить несколько различных антисывороток или использовать антисыворотки к фрагментам исследуемого антигена
7. Специфичность реакции и основные контроли |
45 |
7.2.Устранение неспецифичности, возникающей из-за гетерогенности антител
Иммуноадсорбция
Антисыворотку можно очистить путем иммуноадсорбции на специфическом антигене, присоединенном к твердой фазе, например к гранулам сефарозы, с последующей элюцией. Од нако необходимо помнить о том, что антитела, пригодные для иммуноцитохимического анализа, должны обладать высокой авидностью и, следовательно, их будет трудно элюировать с сорбента. При такой обработке можно потерять много анти тел, и, хотя элюированные антитела будут очень чистыми, авидность их может быть низкой.
Разведение
В результате сильного разведения антисыворотки абсо лютное количество загрязняю щ их антител падает, в то время как количество основных специфических антител все еще ос тается значительным. Количество загрязняю щ их специфиче ски связывающ ихся антител путем разведения может быть снижено до такого уровня, когда ими можно пренебречь.
Адсорбция тканевым порошком, сывороткой или альбумином
Неспецифическое связывание иммуноглобулинов с компо нентами ткани за счет гидрофобных или электростатических взаимодействий можно предотвратить путем адсорбции анти сыворотки компонентами ткани, такими, как альбумин, или порошком ткани (например, печеночным порошком, высушен ным ацетоном) того животного, ткань которого предстоит окраш ивать. Другой метод сводится к предварительной об работке ткани альбумином или неиммунной сывороткой ж и вотного, донора вторых антител. При этом блокируется боль шинство участков неспецифического связывания, но обра зующиеся связи слабее, чем связь антиген — антитело, и по этому не мешают первым (специфическим) антителам взаи модействовать с антигеном. К рабочему раствору антител можно такж е добавить нормальную сыворотку до концентра ции 1%. Связывание иммуноглобулинов с Fc-рецепторами при окраш ивании фиксированной ткани обычно не наблюдается, однако при исследовании поверхностных антигенов на живых клетках в культуре или в суспензии могут возникать трудно сти. Неспецифических реакций такого рода можно избежать, работая с F ab -фрагментами вместо целых молекул иммуно глобулинов.