Материал: Введение в иммуноцитохимию современные методы и проблемы, Мир, М., 1987

46 7. Специфичность реакции и основные контроли

Адсорбция специфическим антигеном

После адсорбции специфическим антигеном антитела дол­ жны терять способность окраш ивать ткань. Родственные или посторонние антигены не должны связывать антитела и вли­ ять на их активность. Такой контроль необходимо ставить с каждой новой антисывороткой и при обнаружении новых то­ чек взаимодействия антител с тканью . В любом опыте важ но иметь положительный контроль — окраш ивать заведомо по­ ложительную ткань, для того чтобы убедиться в том, что все антитела работаю т нормально.

Удобнее всего проводить адсорбцию на твердофазном им­ муносорбенте (например, на гранулах сефарозы, покрытых антигеном), что позволяет полностью удалить способные к взаимодействию антитела из раствора. При обычной адсорб­ ции в жидкой фазе антитела с низкой авидностью могут вый­ ти из комплекса антиген — антитело и затем связаться с ком­ понентами ткани. Однако на практике такие трудности, ви­ димо, не возникают, так как используемые в иммуноцитохи­ мии антитела должны обладать высокой авидностью, иначе они могут отсоединиться от антигена во время окраш ивания и промывки. Недостаток твердофазных сорбентов в том, что количество вводимого антигена трудно регулировать и, следо­ вательно, трудно сравнивать разные сыворотки между собой. При адсорбции в жидкой фазе количество добавляемого ан­ тигена известно (предпочтительно выразить его в нм оль/м л) и можно сопоставить адсорбцию разных сывороток. Количе­ ство антигена, которое необходимо добавить к антисыворотке, для того чтобы полностью снять окрашивание, можно опре­ делить титрованием. Д ля того чтобы предупредить (за счет конкуренции) неспецифическое связывание антител, присут­ ствующих в разбавленных рабочих растворах в очень не­ больших количествах, со стенками сосуда, в котором предпо­ лагается проводить адсорбцию, к раствору до внесения ан­

пользовать для адсорбции, ограничено. В основе метода ле­ жит конкуренция за антиген между антителами, полученными от животных разных видов. Так, при окраш ивании ткани поч­ ки человека кроличьими антителами к IgG на срез наносят смесь кроличьих и козьих антител к IgG человека, при этом козьи антитела должны быть в избытке. При последующем нанесении на срез козьих антител к IgG кролика или ПАП-

комплекса из кролика специфическое окраш ивание должно быть гораздо слабее, чем при наличии в первом слое только кроличьих антител к IgG человека. Однако самый строгий контроль, конечно, — исчезновение окраски после адсорбции специфическим антигеном.

7.3.Устранение неспецифичности, связанной с перекрестной реакцией

Истинную перекрестную реакцию устранить невозможно. Единственное, что можно посоветовать в этом случае,— по­ пытаться работать с антителами, специфичными к разным частям молекулы, если такие препараты антител имеются.

8.МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ И АНАЛИЗА АНТИГЕНОВ IN VITRO

8.1.Ферментный ^ммуносорбентный метод

Строго говоря, этот метод не является иммуноцитохимическим, его применяют для тестирования антител и антигенов in vitro (Voller et al., 1976; O’Beirne, Cooper, 1979).

При тестировании антител, например в первой порции кро­ ви, взятой у 10 иммунизированных кроликов, известное ко­ личество антигена наносят на внутреннюю поверхность ячеек планшетов, используемых для проведения реакции микрогемагглютинации. Вторым слоем служ ат тестируемые антитела в различных разведениях, третий слой — стандартный препа­ рат козьих антител к иммуноглобулинам кролика, конъюги­ рованных со щелочной фосфатазой. Затем фермент проявляют, а окраску оценивают визуально или при помощи колоримет­ ра. Конечно, в каждом эксперименте необходимо ставить по­ ложительные и отрицательные контроли. Вторые антитела можно пометить такж е радиоактивной меткой, а результаты оценивать при помощи сцинтилляционного счетчика.

Метод ELISA менее чувствителен, чем радиоиммунологи-

иммуноцитохимии. Этот метод и менее надежен, ведь количе­ ство пептида, которое сорбируется на пластиковой подложке, непредсказуемо, не ясно такж е, какие части молекулы ока­ жутся доступными антителам. Следует отметить, что этот метод ближе к иммуноцитохимическому анализу, так как ме­ ченым является антитело, а не антиген. В тех случаях, когда нет возможности воспользоваться радиоиммунологическим анализом для проверки антител, выявления перекрестной ре­

Berson, 1959; для знакомства с методом см. Self et al., 1976),

его количестве в экстракте. Следует подчеркнуть, что в этом случае метят не антитела, а антиген; меткой служит какой-

8.3.Методы, основанные на использовании реплик, полученных путем электрофоретического переноса

Для идентификации белковых компонентов ткани, взаи ­ модействующих с антителами, белки тканевого экстракта разделяю т путем электрофореза в полиакриламидном геле. Прямо окраш ивать гель антителами неудобно, поэтому р аз­ деленные белки переносят из геля на нитроцеллюлозную бу­ магу и затем полоску бумаги окраш иваю т антителами с ис­ пользованием ПАП -метода, так, как если бы это был срез ткани. П араллельно соответствующую полоску полиакрила­ мидного геля красят для выявления разделенных белков и

9.ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Иммунодитохимические методы широко применяются в диагностике различных заболеваний и в исследовательской работе. Благодаря тому, что в настоящее время стало доступ­ ным получение множества чистых препаратов антител, обла­ дающих высокой специфичностью и авидностью, количество научных задач, для решения которых могут использоваться методы иммуноцитохимии, практически не ограничено. Ни­

же приведено несколько примеров.

9.1.Патогистологическая диагностика

Всвязи с тем что в настоящее время множество препара­ тов антител можно приобрести у торговых фирм, а такж е в

результате разработки технологии получения моноклональ­ ных антител иммуноцитохимические методы все шире и шире применяются в диагностике различных заболеваний. Н апри­ мер, лимфомы очень удобно типировать при помощи анти­ тел к тяж елым и легким цепям иммуноглобулинов и моно­

опухолей, что особенно существенно при выяснении происхож ­ дения метастазов. Среди них антитела к тиреоглобулину и кальцитонину при диагностике опухолей щитовидной железы и к щелочной фосф атазе или к антигену из простаты при опухолях простаты. Некоторые полезные в практическом от­ ношении маркеры не специфичны по отношению к какому-то одному типу опухолей, а являю тся общими для ряда ново­ образований и нормальных тканей. Они используются глав­ ным образом в дифференциальной диагностике: например если результаты окраш ивания среза антителами к карциноэмбриональному антигену отрицательны, то можно исклю ­ чить аденокарциному толстой кишки (в том случае, если по­ ставлены все необходимые контроли и ткань правильно под­ готовили и хранили), и, напротив, положительный результат может служить подтверждением диагноза. Окраш ивание ан­ тителами к мембранному антигену эпителия помогает отли­