Материал: Введение в иммуноцитохимию современные методы и проблемы, Мир, М., 1987

Рис. 19. Срез опухоли поджелудочной железы, секретирующей глюкагон. Окрашен при помощи метода пероксидазы — антипероксидазы. Обратите внимание на зону пролиферации в опухоли, содержащую глюкагон-положи- тельные клетки (отмечены стрелками). Подготовка ткани: ткань фиксиро­ вали раствором Боуина, галивали в парафин; толщина среза — 4 мкм, до­ крашено гематоксилином.

холей эндотелиального происхождения, нейрон-специфическая энолаза маркирует опухоли нервной ткани и эндокринной системы, а глиальный фибриллярный кислый белок — опухо­ ли глии. Тип обнаруживаемых иммуноглобулинов и их лока­ лизация очень важны при диагностике многих заболеваний почек и кожи, для ряда других заболеваний характерно при­ сутствие в кровотоке аутоантител, которые можно обнару­ жить при окрашивании нормальной ткани сывороткой боль­ ного. При помощи специфических антител можно обнаружить и идентифицировать микроорганизмы. Опухоли эндокринной

должны совершенствоваться методы подготовки ткани и по­ лучения специфических препаратов антител.

Будут использоваться и другие неиммунологические ме­ тоды специфической маркировки, возможно в сочетании с иммуноцитохимическими методами. Например, уж е разработа­ ны методы локализации гормонов, меченных радиоактивными

чаях даж е на фиксированных парафиновых срезах (Taylor et al., 1981). Поскольку фиксация и заливка, вероятно, повре­ ждаю т рецепторы (Salih et al., 1979), в дальнейшем методы окраш ивания при помощи антител для изучения антигенов, связанных с рецепторами на поверхности клетки или после

для локализации комплементарной ей информационной РН К , что дает возможность выявить точки синтеза пептида в цито­

подхода с иммуноцитохимическими методами поможет отве­ тить на множество вопросов, касающ ихся локализации мест

двух или нескольких веществ.

10. МИКРОСКОПИЯ

такой длины волны, при которой наблю дается максимальное возбуждение флуоресцентной метки. В тех случаях, когда име­ ется видимый продукт реакции, например при окрашивании пероксидазой, препараты просматривают в обычный микро­ скоп, который может быть снабжен приспособлениями для темного поля, эпиполяризации или дифференциально-интер­ ференционного контраста по Номарскому.

Флуоресценцию принято наблю дать в системе эпииллю ­ минации, когда падающий свет проходит через линзы объек­ тива, который в данном случае функционирует как конден­ сор, и фокусируется на образце. Испускаемый свет проделы­ вает тот ж е путь в обратном направлении к глазу. При этом падающий свет не поглощается предметным стеклом, на ко­ тором леж ит образец. Система эпилюминесценции позволяет следить за флуоресценцией и рассматривать препарат в про­ ходящем свете или при помощи фазово-контрастной оптики; таким образом, одновременно могут быть видны окрашенные и неокрашенные флуоресцентным красителем части образца.

Обычно источником света при работе с иммунофлуоресцентными препаратами служит ртутная или ксеноновая л ам ­ па, а свет, длина волны которого обеспечивает максимальное

и родамин, и флуоресцеин, микроскоп должен быть оснащен двумя наборами фильтров. Красное свечение родамина и зе­ леное свечение флуоресцеина нельзя увидеть одновременно, так как длина волны максимального возбуждения у этих ве­ ществ разная (родамин — 530 нм, флуоресцеин — 495 нм). Если препарат был окрашен по двум антигенам одновремен­ но (например, Т-лимфоциты — родамином, а В-лимфоциты — флуоресцеином), то его сначала нужно просмотреть с одним

а участки ткани, содержащ ие обе метки, окажутся оранж евы ­ ми. Этот метод может потребоваться, например, при провер-

Рис. 20. Срез мозга человека. Видны нормальные астроциты, окрашенные при помощи ПАП-метода антителами к глиальному фибриллярному кисло­ му белку (Л). Обратите внимание на усиление, которого удается добиться при помощи интерференционно-контрастной оптической системы Номарского (В). Подготовка ткани: ткань фиксировали формалином и заливали в парафин. Срез (6 мкм) до окрашивания был обработан трипсином. Д окра­ шено гематоксилином.

ке сыворотки на присутствие аутоантител к клеткам, проду­ цирующим гастрин; при этом проводят окраш ивание среза стенки кишечника исследуемой сывороткой и антителами к гастрину (Scherbaum et al., 1983), или для того, чтобы от­ личить одну популяцию клеток от другой (Valnes, B randtzaeg, 1982).

При работе с пероксидазой, щелочной фосфатазой, други­ ми ферментными метками или с коллоидным золотом продукт реакции можно наблю дать в обычный микроскоп в проходя­ щем свете. Н а многих препаратах слабоокрашенные или очень тонкие структуры, например нервные волокна, лучше видны, если при просмотре используют дифференциально-интерфе­ ренционный метод Номарского, так как в этом случае изо­ бражение рельефно и окрашенные участки образуют выпук­ лости и вогнутости на плоском фоне (рис. 20).

Если в качестве метки при работе на световом уровне ис­ пользуют коллоидное золото или серебро, то интенсивность окраски, особенно на тонких (1 мкм) срезах при нормальной системе освещения, может быть довольно низкой. С помощью темного поля можно добиться эффекта усиления за счет от­ раж ения света частицами металла; в этом случае объект светится. Еще большее усиление обеспечивает эпиполяриза­ ция (D eM ey, 1983b).

Фотографировать препараты нужно только на подходящую для этого пленку. Kodak техническую пан 2415 используют