Приложение |
61 |
ЗФ Ф Р ) при 37°С. Перед употреблением раствора pH доводят до 7,8 щелочью (N aO H ). Длительность протеазной обработки
определяю т эмпирически |
(см. рис. 2). |
|
|
П.6. Как сохранить срезы прикрепленными |
|
||
к стеклам |
|
|
|
Срезы покрывают |
поли-Ь-лизином (мол. |
масса 150 000, |
|
S igm a). Это особенно |
важно в тех случаях, |
когда предстоит |
|
обработка протеазой, |
а |
такж е при работе с |
предварительно |
фиксированными криостатными срезами «трудной» ткани. |
|||
Н а край чистого стекла осторожно! наносят очень м алень |
|||
кую каплю (около 10 |
мкл) поли-Ь-лизина (1 |
мг/мл) и равно |
|
мерно растираю т ее по |
всему стеклу концом |
другого стекла |
|
так же, как при приготовлении препарата пленки крови. Слой должен быть ровным и настолько тонким, чтобы были видны цветные полоски, возникающие вследствие интерференции света. Стекло высыхает очень быстро. Партию стекол можно приготовить по крайней мере за неделю до использования. Покрытые стекла нужно пометить, так как тонкая пленка не зам етна. Раствор поли-Ь-лизина хранят замороженным.
П.7. Проявление пероксидазы без использования ДАБ
Метод Хэнкера (Hanker et al., 1977)
Реагент Хэнкера—Йейтса1 |
75 |
мг |
|
0,1 |
М трисовый буфер, pH 76, |
100 |
мл |
(или |
ЗФФР) 30% Н 20 2 |
100 мкл |
|
Срезы инкубируют до образования темного сине-коричне- вого продукта реакции. Если требуется, обрабатываю т осми ем. Д окраш иваю т нейтральным красным или кармалем . П ро водят обезвоживание, просветляют и заключают.
Проявление 4-хлор-1 нафтолом (N akane, 1968)
К 4-хлор-1-нафтолу, |
30—40 |
мг |
растворенному в 100%-номспирте, |
0 ,2 —0,5 |
мл |
при помешивании добавляют 0,05 М |
|
|
трисовый буфер, pH 7,6 (или ЗФФР) |
100 мл |
|
затем 30% Н 20 2 |
50— 100 мкл |
|
П еред употреблением необходимо удалить белый осадок фильтрованием.
1 Реагент Хэнкера — Иейтса: одна часть /г-фенилендиамина на две части пирокатехола (производят фирмы Polysciences и Fluka).
62Приложение
Для того чтобы усилить окрашивание, инкубационную смесь нужно нагреть до 50°С, быстро профильтровать черезгрубый бумажный фильтр и инкубировать срезы в горячем фильтрате (Р. Буффа, личное сообщение).
Срезы докраш ивают кармалем . Продукт реакции (темно
синий) |
растворим в |
спиртах, поэтому срезы следует заклю |
чать в |
водные смеси |
(см. фото 2). |
Аминоэтилкарбазольный (АЭ К ) метод (Graham et al., 1965)
Срезы замачиваю т в 0,05 |
М |
ацетатном |
буфере pH |
5,0, за |
|||
тем инкубируют в растворе АЭК: |
|
|
|
|
|
||
Концентрированный раствор |
АЭК1 |
0,5 |
мл |
|
|||
0,05 М ацетатный буфер, |
pH |
5 ,0 |
9,5 |
мл |
|
||
30%-ный |
раствор Н 20 2 |
|
|
|
10 мкл |
|
|
Непосредственно после фильтрации смесь наносят на срез, |
|||||||
и инкубируют |
5— 10 мин. Продукт |
реакции красный. |
Срезы |
||||
докраш иваю т |
гематоксилином. |
Продукт |
реакции растворим |
||||
в спиртах, поэтому срезы промывают подкисленной водой к
заключаю т в водную смесь |
(см. фото 3). |
|
|
|
П.8. Примечания |
|
|
|
|
1. Во всех случаях |
ЗФ Ф Р можно заменять |
физиологическим: |
||
раствором, забуференным трисом, 0,05 М pH |
7,6. |
|||
2. Хранение ДАБ. Д ля того |
чтобы избеж ать |
нежелательного* |
||
контакта с частицами ДА Б |
в виде пыли, можно приготовить- |
|||
концентрированный |
раствор |
(1 г вещества |
на |
40 мл воды) и |
разделить его на |
порции, содержащ ие по |
0,025 г. Раствор1 |
||
можно заморозить; одной порции достаточно для приготовле ния 100 мл инкубационной смеси.
3.Чтобы очистить стеклянную посуду и т. п. от остатков ДАБ,.
еенужно сполоснуть небольшим объемом гипохлорита нат рия (домашнего отбеливателя), в результате чего ДА Б окис ляется.
П.9. Окрашивание при помощи антител, меченных золотом (непрямой метод),
после заливки образца для электронной микроскопии
Подготовка ткани
1. Проведите фиксацию глутаральдегидом или смесью глутаральдегида с формалином 2 ч при 4°С с дополнительной
1 Концентрированный раствор АЭК: 0,4%-ный З-амино-9-этилкарбазол’ в диметилформамиде.
Приложение |
63 |
фиксацией тетраокисью осмия или без нее (в зависимости от исследуемого антигена).
2. Проведите обезвоживание спиртами и окисью пропилена, залейте в эпоксидную смолу.
3. Н ареж ьте срезы толщиной 60— 100 нм, поместите их на чистые, ничем не покрытые никелевые или золотые сеточки, 200—300 мешей. Сушите в течение ночи.
Иммуноцитохимия (см. рис. 15). |
|
|
|
||
Инкубацию удобно вести |
в |
многоячеечных |
планшетах. |
||
В каждую ячейку |
планш ета |
умещается 15 |
мкл раствора. |
||
Предпочтительно |
профильтровать |
все буферы |
и |
растворы, |
|
используемые для промывок через фильтр с диаметром пор *0,45 нм. Сеточки лучше всего промывать каждую отдельно из шприца с микрофильтром; если окраш ивают много сеточек одновременно, их помещают в специальный штатив, который
устанавливаю т в стакане с буфером промывки |
так, |
чтобы |
||||
было возможно слабое перемешивание. Во |
время |
окраш ива |
||||
ния сеточки |
нельзя осушать. |
|
|
|
|
|
1. Обработайте срезы 10%-ным раствором |
перекиси |
водоро |
||||
да, чтобы сделать смолу проницаемой. |
|
|
|
|||
2. |
Промойте |
профильтрованной |
дистиллированной водой. |
|||
3. |
Удалите |
избыток жидкости |
с сеточки и |
поместите ее на |
||
30 мин в каплю нормальной сыворотки животного, донора вторых антител, разведенной 1/30 ЗФ Ф Р, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,01% азида на трия.
4. Удалите избыток нормальной сыворотки с сеточки и по
местите ее в раствор |
первых |
антител, |
приготовленных |
на |
||||
ЗФ Ф Р |
с 0,1% |
БСА |
и 0,1% азида натрия, |
на 1 ч, если инку |
||||
бация |
ведется |
при |
комнатной |
температуре, или на |
48 ч |
при |
||
4°С. Оптимальное разведение |
антител определяют |
экспери |
||||||
ментально-. |
|
|
|
|
|
|
|
|
5. Тщательно |
промойте |
0,05 М трисовым |
буфером, |
pH |
7,2. |
|||
'6. Тщательно промойте тремя порциями 0,05 М трисового бу фера pH 7,2, содержащ его 0,2% БСА. В каждой порции буфе ра инкубируйте 15 мин с перемешиванием.
7. Поместите сеточку в каплю 0,05 М трисового буфера, pH 8,2,
содержащ его 1 % БСА на пять минут. |
|
|
8. Приготовьте раствор вторых антител, меченных |
золотом |
|
(например, козьих антител к IgG |
кролика) в 0,05 |
М трисо- |
вом буфере, pH 8,2, содержащем |
1 % БСА, и путем центри |
|
фугирования в течение 20 мин при |
2000 g удалите микроагре |
|
гаты частиц золота, которые образуются при хранении. Оп тимальное разведение антител определяют экспериментально.
64 Приложение
9. Поместите сеточку в каплю надосадочной жидкости и ин кубируйте 1 ч при комнатной температуре.
10. Тщательно промойте большим объемом 0,05 М трисового
буфера, pH 7,2, содержащ его |
0,2% БСА, затем буфером |
без^ |
БСА и дистиллированной водой. |
|
|
11. Осушите сеточки бумагой, |
адсорбирующей жидкость. |
Д о |
красьте уранилацетатом или цитратом свинца, как для обыч ной электронной микроскопии.
символы
Fc-фрагмент
Fabфрагмент
?(два идентичных антиген* связывающих участка)
Молекула иммуноглобулина
Кролик Коза Мышь Овца
•Символы на Fc-ферменте молекулы иммуноглобулина указывают вид жиiBOTHoro, в котором были получены антитела
Специфические (кроличьи) антитела к Д
Антиген
Срез ткани
Символы на Fc-фрагменте молекулы антител указывают на их специфич ность, т. е. субстрат, с которым связываются антитела
Гидрофобное или |
Меченые антитела, |
электростатическое |
связавшиеся с |
связывание иммуно |
Fc-рецепторами |
глобулинов с тканью |
в ткани |
Неспецифические реакции