56 10. Микроскопия
для получения высококонтрастных черно-белых снимков. Д ля флуоресценции хороши пленки, требующие короткой экспо зиции, так как интенсивность свечения очень быстро убывает под воздействием ультрафиолетовых лучей. Ilford FP4 и Н Р5 больше всего подходят для получения черно-белых фотогра фий флуоресцентных препаратов, a E klachrom 400 — для цветных, однако ы.ам удалось при работе с флуоресцеином по лучить хорошие результаты и на пленке Kodachrom 64, тре бующей гораздо более длительной экспозиции.
Новую пленку A gfachrom 200 профессиональную исполь зуют как для получения фотографий образца в проходящем свете, устанавливая чувствительность 600 ASA, так и для фо тографирования флуоресценции при 1000 ASA. При фотогра фировании образца в проходящем свете с освещением воль
фрамовой |
кварцевой |
лампой |
(12 |
В, 200 |
Вт) |
нужно ис |
пользовать |
фильтр |
W ratten 80 |
А. |
Пленку |
в |
этом случае |
проявляют стандартно, считая чувствительность равной 200 ASA (Cole, Polak, 1984).
Н едостаток флуоресцентных препаратов в том, что они не могут длительно храниться и их необходимо сфотографиро
вать в течение нескольких дней |
после приготовления образ |
||||
ца. Д ля |
того чтобы |
свечение сохранилось |
дольше, |
препарат |
|
нужно хранить в темноте, можно |
такж е добавить к |
смеси, в |
|||
которую |
заключаю т |
препарат, |
25 г /л |
1,4-диазобицикло- |
|
(2-2-2)-октана (Johnson et al., 1982). При большом увеличе нии используются объективы, требующие водной или глице риновой иммерсии.
ПРИЛОЖЕНИЕ: ТЕХНИЧЕСКИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
В этом разделе приводится описание методов, используе мых в тех лабораториях, где работаю т авторы. В литературеможно найти множество вполне удовлетворительных модифи каций этих методов.
П.1. Окрашивание при помощи антител непрямым методом
Иммунофлуоресценция
Парафиновые срезы
1. Удалите воск и поместите срез в воду.
2. Если это необходимо, удалите пигмент путем обработки' иодом и тиосульфатом натрия.
3. Промойте срезы физиологическим раствором, забуференным фосфатом (ЗФ Ф Р) 1.
4. (Н еобязательная стадия). Блокирование участков неспе цифического связывания. Нанесите на срез каплю нормаль ной сыворотки животного, донора вторых антител, разведен
ной 1 |
:30 ЗФ Ф Р. |
|
5. Не |
|
промывая срезы, удалите избыток сыворотки и/или |
(в том |
случае, если блокирование не проводили) вытрите до |
|
суха все предметное стекло, оставив влажной только ту его часть, где находится срез. Предметные стекла поместите го ризонтально в штатив или влажную камеру, например боль шую чашку Петри, в которой лежит кусок мокрой ваты или
фильтровальной бумаги. |
|
|
|
|
6. |
Н а каждый срез нанесите каплю первых антител в ЗФ Ф Р, |
|||
оптимальное разведение |
необходимо |
определить заранее. |
||
7. |
Инкубируйте при 4°С |
(или |
при |
комнатной температуре) |
от |
1 до 48 ч в зависимости от |
разведения антител. |
||
8. Промойте три раза ЗФ Ф Р, каж дая |
промывка — 5 мин. |
|||
9. |
Вытрите досуха все предметное стекло, кроме той его час |
|||
ти, где находится срез. |
|
|
|
|
1 Нормальный физиологический раствор, забуференный 0,01 М фосфа том, pH 7,0—7,2. В раствор первых антител обычно вносят еще бычий сы вороточный альбумин (0,1%) и азид натрия (0,01%).
'58 Приложение
10. Нанесите на срез каплю антител, конъюгированных с флуоресцеином или родамином, например козьих антител к IgG кролика; рабочее разведение необходимо определить заранее, время инкубации при комнатной температуре — 30—
60мин.
11.Промойте три раза ЗФ Ф Р.
12. |
Заключите |
в ^емесь |
ЗФ Ф Р: |
глицерин, 1 :9 |
или 1:1 |
|||||
[в раствор можно внести |
1,4-диазобицикло-(2-2-2)-октан; |
в |
||||||||
конечной концентрации 25 мг/мл |
это соединение |
способству |
||||||||
ет |
сохранению |
флуоресцентных |
свойств |
(Johnson |
et |
al., |
||||
1982)]. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Криостатные срезы |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
Окраш ивание срезов ведется так, как описано выше, |
мето |
||||||||
ды подготовки срезов см. в разд. П.З. |
|
|
|
|
|
|||||
Иммунопероксидазный метод |
|
|
|
|
|
|
||||
Парафиновые срезы |
|
|
|
|
|
|
|
|||
1. Удалите воск и поместите срезы в воду. |
|
|
|
|
|
|||||
2 . |
Если |
это необходимо, |
удалите |
пигмент |
путем |
обработки |
||||
иодом и тиосульфатом натрия. |
|
|
|
|
|
|
||||
3. |
Промойте срезы ЗФ Ф Р. |
|
|
|
|
|
|
|
||
4. |
Д ля |
блокирования эндогенной |
пероксидазной |
активности |
||||||
поместите срезы в 0,3% раствор перекиси водорода |
в ЗФ Ф Р, |
|||||||||
воде или метаноле на 30 мин. |
|
|
|
|
|
|
||||
5. |
Промойте ЗФ Ф Р. |
|
|
|
|
|
|
|
||
6. |
Д ля |
блокирования участков неспецифического |
связывания |
|||||||
обработайте срезы |
нормальной сывороткой и нанесите первые |
||
антитела, как для |
иммунофлуоресценции. |
||
7. |
Три раза |
промойте ЗФ Ф Р. |
|
8. |
Нанесите |
раствор вторых антител, конъюгированных с пе |
|
роксидазой, |
в |
ЗФ Ф Р |
(без азида), инкубируйте 30—60 мин |
при комнатной |
температуре. |
||
9. Три раза |
промойте |
ЗФ Ф Р. |
|
10. Проявите пероксидазу по методу (модифицированному) Грэхэма и Карновского. Приготовьте и профильтруйте рас твор непосредственно перед употреблением. Инкубационная
смесь: 0,025—0,05% |
тетрагидрохлорида диаминобензидина *, |
в 0,015—0,03% Н 20 2 |
в ЗФ Ф Р. Д ля проявления срезы либо |
помещают в емкость с инкубационной смесью, либо каплю раствора наносят непосредственно на срез. За развитием
1 Будьте осторожны! Потенциальный канцероген. См. разд. 5.1.
Приложение 59
окраски следят в микроскоп, обычно достаточно пяти минут инкубации при комнатной температуре.
11.Промойте срезы водой.
12.Окрасьте ядра гематоксилином (слабо) или метиловым зеленым.
13.Проведите обезвоживание, заключите срезы.
Криостатные срезы
Окраш ивание ведется так, как описано выше, методы под готовки срезов см. в разд. П.З.
П.2. Метод пероксидазы—антипероксидазы (ПАП)
|
Следуйте методике, предлагаемой для непрямого иммуно^ |
|||||
пероксидазного |
окраш ивания, по пункт 7 |
включительно. Раз- |
||||
ведение |
первых |
антител при работе с ПАП-системой обычно |
||||
в 10 раз выше, |
чем в случае использования непрямого метода, |
|||||
8. |
Нанесите раствор |
неконъюгированных |
вторых |
антител в |
||
ЗФ Ф Р |
на срез, |
инкубируйте 30 мин. |
|
|
||
9. |
Три |
раза промойте |
ЗФ Ф Р. |
|
|
|
10. |
Нанесите ПАП -комплекс, растворенный в ЗФ Ф Р |
(без азрь |
||||
да ), инкубируйте 30 мин.
11.Три раза промойте ЗФ Ф Р.
12.Проявите пероксидазу так же, как в случае использова ния непрямого иммунопероксидазного метода.
13.Проведите окраш ивание ядер, обезвоживание, заклю чите срез.
П.З. Криостатные срезы
Такие срезы обычно используют при исследовании поверх
ностных антигенов. Д ля |
подготовки срезов было |
предложено |
|||
несколько |
методов. |
|
|
|
|
1. Срезы |
(около 5 мкм) |
высушивают |
в течение |
30 |
мин при |
комнатной |
температуре. |
Фиксируют |
ацетоном |
или |
спиртом |
10 мин при комнатной температуре или при 4°С. Промывают ЗФ Ф Р. Окраш ивают антителами (см. рис. 1).
2. Срезы высушивают при комнатной температуре, заворачи вают в липкую пленку или в фольгу и хранят до момента использования при — 20°С. Н агреваю т до комнатной темпера туры не разворачивая, затем фиксируют ацетоном или спир
том при комнатной температуре или при |
4°С, переносят в |
|
ЗФ Ф Р, высушивают (или не высушивают) |
и окраш ивают ан |
|
тителами. |
|
|
3. Срезы высушивают в течение 30 мин при |
комнатной тем |
|
пературе. Затем проводят высушивание |
из |
замороженного. |
60 Приложение
состояния в течение 18 ч. Хранят завернутыми в фольгу при
— 20°С. Переносят в тепло (комнатная тем пература), фикси руют ацетоном или спиртом 20 мин при комнатной тем пера туре. Переносят в буфер не осушая. Окраш ивают антителами.
В некоторых случаях используют другие фиксирующие растворы — смесь хлороформа с ацетоном, формалина с аце тоном или этанодом, иногда целые кусочки ткани предвари тельно фиксируют этанолом, формалином или бензохиноном. Способ фиксации зависит от особенностей исследуемого ан тигена.
П.4. Усиление пероксидазной реакции
1. После проявления Д А Б срезы обрабатываю т 1%-ным вод ным раствором тетраокиси осм и я1. За почернением продуктов
реакции следят в микроскоп. |
|
|
|
|||
2. Рекомендуют такж е |
метод усиления реакции при помощи |
|||||
тяж елы х металлов. |
Вот один из |
удобных |
вариантов метода |
|||
(H su, |
Soban, 1982). |
К |
100 мл раствора ДА Б при |
перемеш и |
||
вании |
добавляю т 2 |
мл |
1%-ного |
раствора |
хлорида |
кобальта. |
Срезы инкубируют в этом растворе в течение пяти минут,
затем добавляю т соответствующее количество Н 2О2. |
Продукт |
|
реакции сине-черный (см. фото 5). |
|
|
3. Реакцию с Д А Б ведут в присутствии имидазола. |
рН-Опти- |
|
мум пероксидазной реакции около 5,0. |
Чувствительность ме |
|
тода в этой области pH действительно |
возрастает, |
однако |
продукт реакции может диффундировать из места его образо вания и кристаллизоваться. В связи с этим реакцию обычно
ведут при |
нейтральном |
pH. Ш траус |
(S traus, 1982) |
предла |
гает добавлять к раствору ДА Б имидазол до 0,01 М, |
что спо |
|||
собствует |
возрастанию |
скорости и |
интенсивности |
реакции. |
До смешивания с субстратом pH раствора имидазола доводят до нейтрального 1 н. соляной кислотой.
П.5. Обработка протеазами
Этот прием особенно хорош для восстановления «перефиксированных» антигенных участков на парафиновых сре зах после фиксации альдегидами. При работе с полутонкими срезами материала, залитого в смолу (после удаления смо лы ), время инкубации и концентрацию фермента уменьшают.
Срезы помещают в воду, а затем инкубируют |
10— 60 |
мин, |
||
например в 0,1% -ном растворе |
трипсина |
(или |
проназы) с |
|
0,1%-ным раствором хлорида |
кальция (или |
в |
буфере |
типа |
1 С осмием необходимо работать под тягой!