36 6. Варианты основных методов
Меченный радиоактивным |
Неспецифические и загрязняющие |
золотом комплекс |
антитела не содержат метку |
антиген/антитело |
|
Рис. 11. Метод меченого антигена.
Участки неспецифического |
Загрязняющие |
связывания блокированы |
антитела выводятся |
неиммунной сывороткой |
из реакции при |
|
разведении |
Рис. 12. Метод гаптенового сэндвича. |
|
парат антител необходимо метить отдельно и, во-вторых, мето |
|
ды мечения и радиоавтографии сложны, а проявление заним а
ет несколько дней. Разработаны |
аналогичные методы с исполь |
|
зованием антигена, конъюгированного с ферментными |
м етка |
|
ми (M ason, Sam m ons, 1979) |
и золотом (Larsson, |
1979) |
(рис. 1 1 ). |
|
|
6.3. Метод гаптенового сэндвича
Еще один остроумный метод, позволяющий избежать не специфического фонового окраш ивания, — это метод гаптено вого сэндвича с использованием мостика из моноклональных антигаптеновых антител (Jasani et al., 1981). П реж де всего, участки неспецифического связывания блокируют неиммун ной сывороткой животного, донора первых антител. Следую
щий слой — первые антитела, |
меченные гаптеном (маленькая |
|
молекула-антиген, |
например |
имидоэфир динитрофенил амино- |
проприонитрила), |
затем добавляю т моноклональные антитела |
|
к гаптену и далее |
связанный с гаптеном ПАП -комплекс из |
|
6. Варианты основных методов |
37 |
Рис. 13. Комплекс белок А — золото, взаимодействующий с Fe-частью мо лекулы первых антител.
любого вида, который выявляю т при помощи пероксидазной реакции. Окраш иваются только участки ткани, содержащ ие антиген, узнаваемый первыми антителами (рис. 12).
6.4. Мечение при помощи золота
Недавно было разработано несколько методов, основан ных на использовании в качестве метки частиц коллоидного золота. Частицы золота легко идентифицировать при элект ронной микроскопии, вот почему применение этих методов началось именно в электронной микроскопии (Faulk, Taylor, 1971), хотя на световом уровне их использование такж е воз можно. В основе одного из методов (Roth et al., 1978) лежит способность белка А из бактерии Staphylococcus aureus свя зываться с F c-участком молекулы иммуноглобулинов и части цами коллоидного золота. Комплекс белок А — золото служит вторым слоем при окраш ивании, и на электронно-микроско пическом уровне связанные частицы золота обнаруживаю тся только в точках взаимодействия белка А с иммуноглобули нами первого слоя антител (рис. 13).
Этот простой метод находит все более широкое примене ние в иммуноцитохимии на ультраструктурном уровне. Недо статок его в том, что на срезе выявляются все присутствую щие иммуноглобулины, и стадию блокирования нормальной сывороткой приходится опускать. Белок А такж е соединяют
спероксидазой и ферритином.
Внекоторых случаях используют метод выявления анти
гена путем мечения его золотом |
(Larsson, 1979) |
по аналогии |
с радиоиммуноцитохимическим |
методом (см. рис. |
11). Ч асти |
цами золота метят и антитела второго слоя при непрямом
окрашивании (Rom ano |
et al., 1974; H orisberger, 1979; |
De Mey |
et al., 1981, 1983; рис. |
14— 16). |
|
Одно из достоинств методов, основанных на применении в |
||
качестве метки частиц |
золота, состоит в том, что комплексы, |
|
содержащ ие эти частицы, окрашены в интенсивный |
красный |
|
38 6. Варианты основных методов
Повышение интенсивности |
Повышение интенсивности |
окрашивания за счет |
окрашивания за счет |
повторения процедуры |
осадка серебра |
Рис. 14. Антитела, меченные золотом, — непрямой метод.
цвет и хорошо видны в световой микроскоп. При этом, вопервых, можно проверить реакционную способность антител и ткани при помощи световой микроскопии, не прибегая сразу к электронной, и, во-вторых, золото можно использовать для двойного окраш ивания в сочетании с пероксидазой, которую проявляют 4-хлор-1-нафтолом или диаминобензидином; ко нечные продукты реакции при этом окрашены соответственно в синий или коричневый цвет (Gu et al., 1981). Чувствитель ность метода сильно повышается при восстановлении частиц золота лактатом серебра с образованием интенсивно черного
продукта |
(H olgate et al., 1983, b; |
рис. 14). |
М ожно |
приготовить препараты |
коллоидного золота, раз |
личающиеся по диаметру частиц от 5 до 30 нм, и проводить окраш ивание одновременно по нескольким антигенам с после дующим анализом на электронно-микроскопическом уровне. Д ля этого проще всего прямо пометить антитела первого слоя частицами золота разного диаметра (рис. 17). При нанесений такой смеси меченых антител на срез двенадцатиперстной кишки на одном препарате удается продемонстрировать при сутствие в клетках различных гормонов, таких, как холецистокинин, гастроинтестинальный пептид и секретин, поскольку каждый из этих гормонов связывается с частицами опреде
ленного диаметра. М ожно рекомендовать |
такж е непрямой |
метод — двойное или тройное окрашивание, |
проводимые по |
следовательно или параллельно, при помощи антител, не даю щих перекреста (рис. 17), как это делаю т в случае использо
вания |
двойного иммуноферментного метода. |
Иногда |
даж е |
удается покрасить две стороны одной и той |
же элек |
тронно-микроскопической сеточки разными препаратами ан тител, отличающимися по диаметру частиц золота, связанных
6. Варианты основных методов |
39 |
0?8
Рис. 15. Микрофотография среза толстого кишечника человека. Видны сек реторные гранулы в клетке, продуцирующей энтероглюкагон, окрашенные при помощи непрямого метода с использованием кроличьих антител к глюкагону и меченных частицами золота диаметром 20 нм козьих антител к
IgG кролика. Обратите внимание на то, что частицы золота скоцентриро- |
|
ваны в области секреторных гранул. Подготовка ткани: ткань фиксировали |
|
2,5%-ным |
формальдегидом, постфиксацию осмием не проводили, заливали |
в аралдит |
и окрашивали ультратонкие срезы на электронно-микроскопиче |
ских сеточках |
с докрашиванием |
уранилацетатом и нитратом свинца. М — |
митохондрион; |
БМ — базальная |
мембрана. |
с антителами (B endayan, |
1982). Наконец, с помощью этого |
|
метода можно обнаружить в данной грануле или органелле присутствие более чем одного антигена, способного реагиро
вать с антителами (R avazzola, Orci, |
1980; |
V arndell |
et |
al., |
1982). |
|
|
|
|
Успех при использовании данных |
методов, |
так ж е |
как |
и |
методов, основанных на применении пероксидазы или флуо ресцентных красителей, зависит от правильного проведения фиксации и демаскировки тканевого антигена. При соблюде нии всех условий, при правильной подготовке препарата тка ни методы с применением частиц коллоидного золота могут оказаться эффективнее, чем пероксидазный метод и сравне ние полутонких-тонких срезов на электронно-микроскопичес ком уровне.
40 6. Варианты основных методов
Рис. 16. Микрофотография среза нормального Т-лимфоцита крови человека. Клеточную мембрану окрашивали при помощи моноклональных антител ОКТ-4 и меченных частицами золота диаметром 20 нм кроличьих антител к IgG мыши. Положительная реакция с ОКТ-4 указывает на принадлеж ность клетки к подгруппе Т-хэлперов. Подготовка ткани: с антителами ин кубировали нефиксированные клетки; после окрашивания проводили фик сацию 3%-ным формальдегидом, затем тетраокисью осмия и заливали в аралдит. Ультратонкие срезы докрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Микрофотография была любезно предоставлена д-ром Д. Катовски, отделение лейкемий, госпиталь Хаммерсмит, Лондон.
6.5. Авидин-биотиновые методы
Новый перспективный метод мечения основан на исполь зовании биотина и авидина. Он позволяет повысить чувст вительность, не прибегая к ПАП -комплексу, получение кото рого — очень трудоемкая процедура. Авидин — большой гли копротеин, выделяемый из яичного белка и имеющий очень высокое сродство (4 участка связывания) к биотину, низко молекулярному витамину, присутствующему в яичном ж елт ке. Биотин можно присоединить к молекуле антител или к пероксидазе. Авидин такж е можно пометить, скажем, пероксидазой или флуоресцеином. Все эти реагенты используют-