Материал: Введение в иммуноцитохимию современные методы и проблемы, Мир, М., 1987

ка ткани: мозг фиксировали путем перфузии 4%-ным раствором парафор­ мальдегида в ЗФ ФР, затем без замораживания нарезали на вибратоме. Флотирующие срезы толщиной 50 мкм окрашивали антителами без при­ крепления к твердой поверхности. Докрашивание не проводили.

антителами, поскольку они не являю тся анти-IgG. Д ля того чтобы ПАП -комплекс не связывался непосредственно с тк а ­ нью, достаточно провести блокирование нормальной сыворот­ кой, и фоновое окраш ивание будет минимальным. Метод мож ­ но использовать и на ультраструктурном уровне— при помощи электронной микроскопии связанный ПАП -комплекс легко отличить от неспецифически возникающих электроноплотных участков. При использовании методов с мостиками из анти­ тел конечный результат можно усилить последовательным повторением всех этапов процедуры (для сравнения различ­ ных методов с использованием мостиков из антител см. Огdronneau et al., 1981).

32 5. Иммуноферментные методы

Недостатки метода

Н едостаток ПАП -метода в том, что, во-первых, он требует дополнительных реагентов, а, во-вторых, процедура окраш и­ вания удлиняется.

Другие ферментные метки

Д ля конъюгирования с антителами применяют такж е щ е­ лочную фосфатазу. Этот фермент можно использовать и для электронной микроскопии с контрастированием солями свин­ ца. Д ля иммуногистохимии этот фермент не так удобен, как пероксидаза, поскольку его очень много в тканях. Щ елочную фосфатазу с успехом используют при работе методом ELISA (см. ниже) для количественного анализа, так как продукт реакции в этом случае можно сделать цветным и раствори­ мым, что позволит измерять его количество колориметриче­ ски. Этот фермент такж е с успехом используют при окраш и­ вании по двум антигенам одновременно, причем до недавнего времени его присоединяли к антителам не химически, а им­ мунологически.

Достоинство другой ферментной метки, глюкозооксида-

6.ВАРИАНТЫ ОСНОВНЫХ МЕТОДОВ

6.1.Окрашивание по двум или нескольким антигенам одновременно

вместе с пероксидазной меткой смываются со среза кислым

сулин — в синий (фото 2). О краска может быть такж е крас­ ной или зеленой в зависимости от выбранного способа прояв­ ления.

Зеленое окраш ивание дает дигидрохлорид о-дианизидина

Антитела необходимо отмыть до начала второй реакции, так как пероксидаза, использованная в первой реакции, мо­ жет снова прореагировать в реакции проявления второго ан­ тигена, или, если оба препарата первых антител получены в животных одного вида, первые антитела № 2 могут связать­ ся со свободными антителами второго слоя первой реакции. Вот почему необходимо убедиться, что первый комплекс ан­ тиген — антитело полностью удален в результате кислотной промывки.

Один из недостатков этого метода состоит в том, что ан­ титела с высокой авидностью плохо диссоциируют даж е в сильной кислоте. В некоторых случаях эффективнее метод Траму (Tram u et al., 1978), поскольку он в большей степени обеспечивает сохранность антигенов ткани. В первой реак­ ции используют 4-хлор-1-нафтол, после проявления срез фо­ тографируют, затем разруш аю т комплекс антиген — антитело путем обработки среза подкисленным раствором пермангана-

34 6. Варианты основных методов

спирте. Повторное окраш ивание вторыми антителами, исполь­ зуемыми в первой реакции, должно давать отрицательный результат, так как этот комплекс должен быть отмыт полно­

нафтолом не отмывали, то можно следить за распределением двух антигенов одновременно. Было высказано предположе­

ж е при окраш ивании по двум антигенам предпочтительно ис­ пользовать специфические (первые) антитела, несущие р аз­ ные метки (Valnes, B randtzaeg, 1982).

Другой метод, называемый двойным иммуноферментным, основан на использовании щелочной фосфатазы в качестве метки для одних антител и пероксидазы для других в соче­

6. Варианты основных методов 35

5.Нафтол AS—MX фосфат + быстрый голубой + ф (ЩФАЩФ)

4.Н26 2 + ДАБ + С

Рис. 10. Окрашивание по двум антигенам двойным иммунопероксидазным методом с использованием антител к к- и A-цепям (Mason et al., 1983). Каждый слой состоит из двух реагентов. Ферменты проявляют раздельно. и-Цепи окрашиваются в коричневый цвет, ^-цепи — в синий.

метками. Н а всех стадиях, кроме проявления фермента, реактивы, используемые для выявления двух разных анти­

новый метод окраш ивания с помощью антител, называемый радиоиммуноцитохимическим (РИ Ц Х ). В соответствии с этим методом радиоактивную метку (1251 ) присоединяют к антигену,