3. Условия для проведения иммуноцитохимии |
21 |
реакцию по желанию можно остановить. Необходимо конт ролировать соотношение количества флуоресцентной или ферментной метки с количеством антител при конъюгации. Избыток метки может повлиять на активность антител; несвязавш ую ся метку необходимо удалить до использования антител путем диализа или колоночной хроматографии. Все молекулы антител должны нести метку, так как немеченые
лнтитела будут конкурировать с мечеными за |
антиген и, |
та |
ким образом, снижать количество видимого |
продукта |
ре |
акции. |
|
|
Помимо ферментных методов с использованием немеченых антител было предложено еще несколько способов усиления интенсивности окраски при пероксидазной реакции. Эти ме тоды основаны либо на повышении чувствительности реакции, что позволяет выявлять меньшее количество антигена при той же концентрации антител, либо на повышении специфичности реакции. В этом случае то ж е самое количество антигена уда ется выявить при меньшей концентрации антител, что дает
возможность |
вывести |
из реакции загрязняю щ ие |
антитела за |
|||
счет разведения. Д ля |
докраш ивания ядер |
или |
компонентов |
|||
ткани нужно |
выбирать |
такие |
реагенты, которые обеспечат |
|||
контрастный |
фон и не |
снизят |
интенсивности |
основного окра |
||
шивания.
Дл я световой микроскопии окраску золотом (см. разд. 6.4) можно усилить при помощи эпиполяризационной оптики (см.
разд. |
1 0 ) или |
нового |
метода, основанного на осаждении се |
ребра |
(H olgate |
et al., |
1938, а, b). Что ж е касается электронной |
микроскопии, то преимущество коллоидного золота как метки состоит в том, что его частицы лучше видны на фоне докра шенного обычными способами препарата, чем продукт перо
ксидазной |
реакции |
после |
проявления |
диаминобензидином |
|
(ДА Б) |
и обработки |
осмием. |
|
||
М етод |
мечения |
антител флуоресцеинизотиоцианатом |
|||
(Ф ИТЦ ) |
прост и вкратце |
сводится к |
следующему (Stern- |
||
berger, |
1979): |
|
|
|
|
1 ) |
выделение IgG; |
|
|
||
2)реакция с Ф ИТЦ при щелочном pH и правильном соот ношении реагента и антител;
3)очистка антител от свободного Ф ИТЦ на колонке с сефадексом G25;
4)разделение меченых и немеченых IgG на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.
При мечении пероксидазой для |
присоединения |
фермента |
|
к антителам |
используют, например, |
глутаровый |
альдегид. |
Приготовить |
ПАП -комплекс сложнее; для этого требуется до |
||
полнительная очистка. При мечении золотом антитела присое
22 3. Условия для проведения иммуноцитохимии
диняют к частицам золота за счет нековалентной адсорбции. Эти реактивы можно купить. Они, конечно, дороги, однако* их стоимость частично компенсируется экономией времени и:
усилий, которые тратятся на приготовление собственных реа гентов.
Все антитела, собственного производства или приобретен ные, перед употреблением необходимо оттитровать на заве домо положительном материале, для того чтобы найти рабо чее разведение, которое зависит такж е и от времени окраш и вания. Короткая инкубация (10— 60 мин) требует более высо кой концентрации антител, чем длительная (12— 24 ч), и не редко приводит к повышению неспецифического связывания,,
так |
как в этом случае не происходит необходимого разведе |
ния |
загрязняю щ их антител. |
4. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ
4.1. Прямой метод
Исходная методика |
окраш ивания, разработанная |
Кунсом |
|
(Coons, K aplan, 1950), |
была одностадийной |
(прямой); |
в этом |
случае Ф И ТЦ присоединяли прямо к специфическим |
антите |
||
лам . Меченую антисыворотку разводили |
физиологическим |
||
раствором, забуференным с помощью фосфата (ЗФ Ф Р ), а за тем наносили на срез ткани и после инкубации несвязавшие-
ся антитела удаляли, промывая |
срез ЗФ Ф Р. |
Окрашенный |
|
срез |
просматривали в микроскоп |
с ультрафиолетовой опти |
|
кой; |
при этом в точках связывания антител |
наблю дали яб |
|
лочно-зеленую флуоресценцию (рис. 3).
4.2. Непрямой метод
Оригинальная методика была модифицирована, -и сейчас широко используется непрямой метод (Coons et al., 1955; рис. 4 и 5, а такж е фото 1). В этом случае за первыми спе цифическими немечеными антителами следует второй слой, содержащ ий антитела к у-глобулинам животного, донора пер вых антител, например козьи антитела к у-глобулинам кро лика, меченные ФИТЦ . Первые антитела (кроличьи), связав шиеся с участками среза ткани, содержащ ими нужный анти ген, в свою очередь служ ат антигеном для вторых флуорес центных антител (рис. 6 ).
Достоинства метода
1. Антисыворотки к IgG обычно имеют высокий титр и авидность.
2.С каждой молекулой первого (специфического) анти тела могут связаться две меченые молекулы антииммуногло булинов, что увеличивает чувствительность метода.
3.Экономичность. Один препарат флуоресцентных антител второго слоя может быть использован для окраш ивания мно жеством первых антител, взаимодействующих с разнообраз ными антигенами; необходимо только, чтобы все они были по лучены при использовании животных одного вида, а именно
того, к IgG |
которого специфичны антитела |
второго |
слоя. |
В настоящее |
время налаж ен выпуск меченых |
антител |
для |
24 4. Иммунофлуоресцентные методы
Специфическая реакция антиген—антитело с мечеными
первыми антителами
Связывание с Fc-Образование гидрофобных и |
Загрязняющие антитела |
|
рецепторами (только на |
электростатических связей (специфические, но ненужные^ |
|
нефиксированной ткани) |
между мечеными Ig и |
|
|
компонентами ткани |
|
ч*
" < 3vV
|АГ
!А[
Блокирование |
Блокирование гидрофобных |
Осуществление специфичес- |
Fc-рецепторов |
и электростатических |
ких реакций с участием |
|
взаимодействий |
основных и загрязняющих |
|
|
антител |
Рис. 3. Прямой метод. А. Первые антитела конъюгированы с флуоресцеиноь® (или с пероксидазой). Неспецифические антитела также оказываются ме чеными. Б. Показаны некоторые неспецифические реакции, связанные с возникновением гидрофобных и электростатических взаимодействий между иммуноглобулинами и компонентами ткани, а также реакции загрязняющих антител с антигенами ткани. Путем обработки срезов неконъюгированной неиммунной сывороткой животного, донора антител, или инертным белком, таким, как альбумин, до инкубации с первыми антителами эти реакции можно частично блокировать. В. Метод удобен для окрашивания по двум? антигенам одновременно; в этом случае два препарата первых антител ме тят разными метками, например родаминизотиоцианатом и флуоресцеини-
зотиоцианатом (Valnes, B randtzaeg, 1982).
4. Иммунофлуоресцентные методы |
25 |
Рис. 4. Срез толстого кишечника человека. Окрашивание проводили с по мощью непрямого иммунофлуоресцентного метода с использованием кро личьих антител к глюкагону и конъюгированных с флуоресцеином козьих
антител к IgG кролика. Видны энтероглюкагоновые клетки; |
|
основание |
|||
флуоресцирующих клеток покоится на базальной мембране |
(стрелка), апи |
||||
кальная поверхность обращена |
к просвету. Подготовка |
ткани: |
ткань |
||
фиксировали раствором я-бензохинона; толщина криостатных |
|
срезов — |
|||
6 мкм. |
|
|
|
|
|
второго слоя. Помимо флуоресцеина используют |
и |
другие |
|||
метки, например родамин, |
флуоресцирующий |
в |
оранж ево |
||
красной области, однако интенсивность свечения у |
|
него |
ни |
||
же, чем у ФИТЦ . Родамин обычно используют при |
окраш и |
||||
вании по двум антигенам |
одновременно. |
|
|
|
|
3— 1203