2. Получение антител |
11 |
антител часто оказывается не очень хорошим для иммуноци тохимии, и наоборот. ELISA несколько ближе к иммуноцитохимическому методу.
2.3.Антисыворотки, специфичные
котдельным участкам молекулы антигена
Реагенты, используемые при конъюгации, обладаю т р аз личной специфичностью в отношении функциональных групп молекулы гаптена. Например, глутаровый альдегид присоеди няется прежде всего к аминогруппам. Обычно свободный ко нец молекулы гаптена, противоположный тому, которым гаптен прикреплен к носителю, более активно стимулирует об разование антител, и, следовательно, если единственная в молекуле аминогруппа ЫН2-концевая, то при иммунизации гаптеном, конъюгированным с носителем при помощи глутарового альдегида, более вероятно образование антител к сво бодному С-концу. Карбодиимид взаимодействует со свобод ными карбоксильными и аминогруппами; следовательно, при иммунизации гаптеном, конъюгированным при помощи карбодиимида, скорее всего получится смесь антител к С- и N- концам. Зная структуру гаптена и правильно выбрав реагент для конъюгации, можно получить антитела, специфически взаимодействующие с определенным участком молекулы гап тена (Szelke, 1983).
При работе с пептидами часто оказывается удобным иметь антитела, узнающие только определенный участок мо лекулы. Если исследуют распределение двух пептидов со сходной последовательностью аминокислот (например, гастрин и холецистокинин, имеющие одинаковые пентапептиды с С -конца), антитела должны отличать их друг от друга. Боль шинство антител узнает последовательность из 4— 8 амино кислот, и только случайно антисыворотка может содержать антитела, специфичные именно к нужному фрагменту моле кулы. Не всегда можно положиться на результаты экспери ментов, в которых исследуют взаимодействие антител с р аз личными изолированными фрагментами антигена, так как в растворе фрагмент может утратить свою специфическую кон фигурацию, обусловливающую его антигенные свойства в составе целой молекулы. Антигенной детерминантой может быть не только определенная последовательность аминокис лот, но и участок молекулы, образованный уложенными в пространстве аминокислотными остатками. Д ля иммунизации можно использовать синтетические фрагменты молекулы, что повышает вероятность получения антисыворотки, специфич ной к этим фрагментам. Однако, чем короче пептид, тем ниже
2'
12 2. Получение антител
его антигенность, и шансы получить хороший препарат ан тител к фрагменту пептида невелики. Кроме того, чем короче аминокислотная последовательность, тем выше вероятность того, что она будет встречаться в нескольких различных пеп тидах. Таким образом, при иммуноцитохимическом анализе распределения пептидов очень часто приходится использовать антитела к различным участкам молекулы, например к N- концу, средней части и С-концевому фрагменту. Только в ре зультате окраш ивания таким набором антител можно с уве ренностью утверждать, что локализован действительно ис следуемый пептид или, напротив, получены сведения о рас пределении родственной, но не идентичной молекулы (Larsson, 1980).
2.4. Моноклональные антитела
Недавно |
был предложен метод, обеспечивающий получе |
||||||
ние чистых |
препаратов антител |
даж е |
в случае иммунизации |
||||
целой молекулой. (Подробнее |
о |
моноклональных |
антителах |
||||
и области их применения см. |
M ilstein |
et |
al., 1979; |
M ilstein, |
|||
1980; |
M cM ichael, Fabre, 1982.) |
Д ля этого |
прежде |
всего про |
|||
водят |
иммунизацию мышей, |
затем |
лимфоциты |
селезенки |
|||
(клетки, синтезирующие антитела) сливают с культивируемы
ми клетками мышиной миеломы. После |
слияния гибридные |
||
клетки продолжаю т расти и |
делиться |
в культуре, |
а так ж е |
синтезировать антитела. Одна |
клетка |
продуцирует |
только |
один тип антител, поэтому в результате клонирования удает ся получить клеточную линию, секретирующую одинаковые антитела. Отбор нужных клонов производят, анализируя культуральные жидкости на присутствие антител при помощи радиоиммунологического метода, ELISA или иммуноцитохи мии. Таким способом удается отобрать моноклональные ан титела, узнающие отдельные участки молекулы, а поскольку
гибридные клетки |
можно хранить сколь угодно долго, до* |
тех пор пока они |
не понадобятся вновь, метод обеспечивает |
получение стандартного препарата антител для длительной работы. Смесь моноклональных антител, направленных к р аз ным участкам молекулы, может служить надежным иммуно красителем.
М оноклональные антитела используют не только в тех случаях, когда требуются чистые антитела к известному анти гену; иногда получают моноклональные антитела к неизвест ным антигенам, которые могут служить маркерами определен ных типов клеток или внутриклеточных компонентов. Так, на пример, были проведены опыты, в которых мышей иммуни зировали тимоцитами человека, и в результате клонирования
2. Получение антител |
13 |
Рис. 1. Срез миндалины человека. Окрашивание проводили при помощи не прямого иммунопероксидазного метода с использованием моноклональных антител к мембранам Т-лимфоцитов и конъюгированных с пероксидазой кроличьих антител к IgG мыши. Препарат докрашен гематоксилином. Об ратите внимание на то, что Т-клетки сосредоточены главным образом на периферии, в центре фолликула клеток немного. На вставке видно, что ан титела действительно взаимодействуют с мембраной. Подготовка ткани: криостатный срез (4 мкм ), тщательно высушенный на воздухе, фиксировали 10 мин 100% этанолом при 4°С, затем перенесли в забуференный фосфатом физиологический раствор и в дальнейшем не осушали.
был получен набор антител к Т-лимфоцитам человека. Эти антитела используют для иммуноцитохимического разделения клеток, принадлежащ их к различным типам (K ung et al., 1979). Антитела узнают какие-то компоненты клеточной мем браны, однако химическая природа антигенов неизвестна
(рис. 1 ).
М оноклональные антитела, полученные в результате им мунизации мышей гомогенатом мозга крысы, оказались чрез вычайно полезными при исследовании взаимоотношений м еж ду различными группами клеток мозга (S ternberger, 1983).
Разработка методов получения моноклональных антител имела поистине революционное значение для иммуноцитохи мии. Можно с уверенностью утверждать, что при помощи моноклональных; антител в клеточной биологии будет сделано еще много открытий.
14 2. Получение антител
2.5. Свойства «хороших» антител
Основное требование, предъявляемое к антителам, — вы сокое сродство к антигену; иными словами, узнающие участ ки молекулы антитела должны быть хорошо «подогнаны» к
антигенным |
участкам молекулы его специфического антигена |
||||||||
и при этом |
не |
узнавать |
другие антигены. Авидность, |
или |
|||||
сила связывания, зависит |
от |
количества |
прикрепляющихся |
||||||
друг к другу участков в |
молекулах |
антигена |
и |
антитела |
|||||
(Roitt, 1980). |
Д ля иммуноцитохимии |
требуются |
антитела, |
||||||
обладающ ие |
высокой авидностью (липкостью ), |
|
иначе |
при |
|||||
проведении |
окраш ивания |
их |
можно смыть со среза. |
|
|||||
К счастью, |
загрязняю щ ие |
антитела |
часто |
связываются |
|||||
слабее, чем |
специфические, и в процессе |
окраш ивания |
могут |
||||||
смываться. Однако при работе с гистологическими срезами поврежденной или разрушенной ткани, т. е. с материалом, обычным для патогистолога, или с клетками в мазках следует проявлять осторожность, так как эти препараты неспецифи чески сорбируют антитела. В этих случаях, как впрочем и всегда, необходимы очень строгие контроли.
Очень важен такж е титр, или концентрация, антител. При
высоком |
титре за |
счет сильного разведения сыворотки во вр е |
|||
мя окраш ивания |
ткани |
загрязняю щ ие |
антитела |
могут быть |
|
выведены |
из реакции. |
В случае радиоиммунологического |
|||
анализа, |
где рабочее разведение обычно примерно в 10 ООО раз |
||||
выше, чем при иммуногистохимическом |
подходе, |
антитела |
|||
взаимодействуют практически только со специфическим анти геном и побочные реакции несущественны. Тем не менее и в этом случае сильное разведение антител ведет к удалению из
сферы |
реакции загрязняю щ их белков и дает возможность по |
ниж ать |
количество используемого меченого лиганда, что сни |
ж ает шумы, возникающие из-за избыточной радиоактивности. Ещ е одно преимущество работы с высоким разведением — возможность наиболее полно использовать имеющееся коли чество проверенных, пригодных для работы антител, которые, кстати, довольно дороги. К сожалению , пока мы не знаем надежных способов получения препаратов антител с высокой авидностью и титром.
В тех случаях, когда ведется работа с моноклональными антителами, фактор разведения не так важен, так как в прин ципе можно получить неограниченное количество антител, и побочных реакций практически нет.
3.УСЛОВИЯ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Условия, необходимые для проведения иммуноцитохимического анализа, перечислены в табл. 1 .
Таблица 1. Факторы, существенные для иммуноцитохимического анализа
1. Сохранность антигена (см. табл. 2)
2.Специфичность окрашивания (см. табл. 4, разд. 7)
3.Хорошо охарактеризованный препарат антител
4.Удобная метка
3.1.Нерастворимый, доступный антителам антиген
Для успешного окраш ивания необходимо сделать ткане вые антигены нерастворимыми, но при этом антигенные уча стки их молекул должны более или менее сохранить свою пространственную структуру и быть доступными антителами. Помимо этого нужно зафиксировать общую структуру ткани для того, чтобы после окраш ивания на препарате можно было идентифицировать иммунореактивную клетку или органеллу.
Раньш е считалось, что хорошая фиксация ткани делает ее не проницаемой для антител, так как под воздействием обычных альдегидных фиксаторов образуются множественные попереч ные сшивки между тканевыми белками. Однако недавние р а боты показали, что при правильной предварительной обра
ботке ткани эти фиксаторы все ж е |
можно использовать, при |
чем в некоторых случаях даж е для |
электронной микроскопии |
с постфиксацией тетраокисью осмия. Эти результаты явля ются, по-видимому, следствием улучшения качества препара тов антител и доработки некоторых методических деталей. Большинство пептидных гормонов и нейропептидов хорошо сохраняются при высушивании замороженной ткани с после дующей обработкой парами слабосшивающих реагентов, т а ких, как формальдегид, я-бензохинон или диэтилпирокарбонат (Pearse, Polak, 1975), однако этот метод не обеспечивает хорошей сохранности ткани, что необходимо для электронной микроскопии. При заливке, когда ткань пропитывается горя чим воском или эпоксидной смолой, антигенные детерминан