Материал: Введение в иммуноцитохимию современные методы и проблемы, Мир, М., 1987

i б 3. Условия для проведения иммуноцитохимии

ты ряда пептидов такж е могут пострадать. Многие авторы для световой микроскопии, в частности при выявлении пеп­ тидов в нервной ткани, предпочитают использовать криостатвы е срезы, предварительно фиксированные забуференным формальдегидом или я-бензофиноном путем погружения или

протеолитическими ферментами Перйодат-лизин-параформальдегид; фик­ Иммуноцитохимические исследова­

Недавно было показано, что фиксация пептидов я-бензо- хиноном проходит лучше при повышении температуры до 37°С

и pH до 8,0 (B u’Lock et al., 1982); в этих условиях образует­ ся больше сшивок. Фиксацию формальдегидом такж е можно улучшить, изменив pH раствора. М етод фиксации, предло­ женный для локализации тирозингидроксилазы, растворимо­ го антигена, состоит в следующем (Berod et al., 1981): перфу­ зию формальдегидом проводят при pH 6,5; при этом ф икса­ ция идет очень плохо, но формальдегид быстро проникает в ткань; затем pH резко поднимают до 11, что стимулирует об-* разование сшивок.

При работе с предварительно фиксированными криостатными срезами, препаратами органных и клеточных культур,

С этой целью препарат перед окрашиванием выдерживаю т в

полученных в результате заливки в пластмассу. Н аш опыт под­ сказывает, что необходимости в этом нет, однако присутствие детергента в буфере, используемом для промывки, мож ет препятствовать неспецифической сорбции белков на срезе и таким образом снижать фоновое окрашивание.

Существует и другой подход — ступенчатое обезвож ива­ ние препарата в этаноле, затем в ксилоле с регидратацией не­ посредственно перед окрашиванием. Н едостаток этого метода заклю чается в том, что при таком способе обработки чувстви­ тельные к растворителям антигены могут быть потеряны.

Если ткань, с которой предстоит работать (кишечник или поджелудочная ж елеза), содержит много протеолитических ферментов, то в фиксирующий раствор и буфер для промывки полезно ввести ингибиторы протеаз, например тразилол. Э то может помочь сохранить общую структуру ткани, а такж е некоторые лабильные пептиды, такие, как вазоактивный ин­ тестинальный полипептид.

нат и n -бензохинон; в этих случаях материал (обычно свеж е­ замороженные криостатные срезы) просто фиксируют форма­ лином.

Д ля электронной микроскопии были разработаны методы предварительной заливки и заливки после окраш ивания. Вибратомные или криостатные срезы фиксированного образца можно окрасить антителами и сделать продукт реакции элек­ троноплотным до заливки образца в смолу. Преимущ ество этого метода состоит в том, что, во-первых, антигены не кон­

но найти и отметить хорошо окрашенный участок. Н едостаток

18 3. Условия для проведения иммуноцитохимии

необходимости, поскольку внутриклеточное содержимое и так доступно антителам.

Новейшие методы современного иммуноцитохимического

.анализа на электронно-микроскопическом уровне позволяют использовать ультратонкие срезы замороженной предвари­ тельно фиксированной ткани (Tokuyasu, 1980, 1983). Эти сре­ зы можно окраш ивать^на электронно-микроскопических се­ точках без проводки через растворители и смолы. Метод ис­

фибробластов (W illingham , 1980)— смесь карбодиимида с глутаровым альдегидом (в качестве метки используют ферритин). Свежезамороженные криостатные срезы, фиксирован­ ные спиртом или ацетоном, обычно применяют при изучении поверхностных антигенов лимфоцитов иммуноглобулиновой природы (см. рис„ 1 ). Д ля локализации пептидов эти методы применяются редко.

Выбор метода фиксации определяется спецификой конкрет­ ной реакции антиген — антитело и предполагаемой локализа­ цией антигена. В тех случаях, когда фиксацию ведут погру­ жением в раствор или парами фиксатора после высушивания

представляет собой не вполне понятный, но важный в практи­ ческом отношении способ выявления «крепко сшитых» при

ются сшивки, образованные фиксатором; при этом освобож ­ даются антигенные участки. Некоторые антигены при инку­ бации с ферментом разруш аю тся, большие белковые молеку­ лы (например, предшественники биологически активных пеп­ тидов) могут расщепиться на фрагменты, и, если при этом экспонируются антигенные участки, маскированные в пред­ шественнике, можно получить ошибочную положительную реакцию. Учитывая возможные артефакты, мы рекомендуем проводить обработку протеазами в тех случаях, когда пред­ варительное окраш ивание антителами оказалось слишком

Рис. 2. Срез двенадцатиперстной кишки человека. Окрашивание на родст­ венный фактору V III белок, маркер эндотелиальных клеток, проводили при помощи системы пероксидаза — антипероксидаза с использованием кро­ личьих антител к фактору V III, козьих антител к IgG кролика и кроличье­ го ПАП-комплекса. Л. Срез окрашивали без обработки трипсином. Б. Срез прилежащего участка ткани, окрашенный после 30 мин обработки 0,1%-ным

интенсивно. Докрашено гематоксилином. Подготовка ткани: ткань фикси­

слабым (рис. 2). Этот вопрос обсуждается в работе Финли и Петруц (Finley, Petrusz, 1982). Конкретные детали см. в разд. П .5.

Обработка окислителями

успехом применяют для иммуноцитохимических исследований ка электронно-микроскопическом уровне. Ультратонкие срезы ткани, фиксированной глутаральдегидом и осмием, иногда об­