Материал: Возбудитель Холеры
31
О-холерной сывороткой. Выдают второе заключение о природе выделенного вибриона. Подозрительные колонии с плотных питательных сред пересевают на среды Ресселя или Клиглера для выделения чистых культур.
III этап. Через 12-16 часов от начала исследования производят пересев со второй среды накопления на щелочной МПА, повторно изучают морфологию, подвижность и агглютинабельность культуры, выросшей на второй среде накопления и на плотных питательных средах. При положительных результатах исследования агглютинабельности колоний выдают третье заключение о результатах исследования.
IV этап. Через 18-24 часа с начала проведения работ подозрительные колонии с плотных питательных сред исследуют в реакции агглютинации с холерными сыворотками (О1, О139, Инаба, Огава) и пересевают на двууглеродные среды (лактозосахарозная, глюкозолактозная, Клиглера) и щелочной агар для выделения чистой культуры и ее идентификации.
V этап. Через 24-36 часов от начала исследования отбирают подозрительные колонии и проводят идентификацию культур по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, подвижности, агглютинации с помощью диагностических агглютинирующих сывороток О, ОR, Инаба и Огава, фаголизабельности с холерными диагностическими фагами.
VI этап. Через 36-48 часов от начала исследования учитывают результаты идентификации выделенных культур и выдают окончательный ответ о возбудителе.
При подозрении на холеру часто проводят ускоренную диагностику по З.В. Ермольевой. Для этого исследуемый материал (испражнения) высевают в пептонную воду, пептонную воду с О-сывороткой и пептонную воду с крахмалом. При положительном результате в пептонной воде наблюдается характерный рост культуры в виде нежной голубоватой пленки на поверхности среды, в среде с О- сывороткой отмечается агглютинация вибрионов, а среда с крахмалом не изменяет своего цвета при добавления йода в результате разложения крахмала.
В настоящее время для экспрессной диагностики применяют метод флюоресцирующих антител (МФА), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), реакцию иммобилизации вибрионов (РИВ), реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА).
МФА позволяет идентифицировать выделенную культуру, а также выявить возбудителя холеры серогруппы О1 при его содержании в исследуемом материале не менее чем 105 микробных клеток в 1 мл. МФА используют для исследования нативного материала от больных (испражнения и рвотные массы), материала после подращивания на питательной среде, для выявления холерных вибрионов в воде и смывах.
ПЦР основана на определении генов холерного токсина (ctxAB) и токсинкорегулируемых пилей (tcpA). Этот метод используют для исследования испражнений, рвотных масс, воды, смывов, стоков, чистых культур вибрионов.
РИВ основана на утрате подвижности холерных вибрионов под влиянием специфических сывороток. Эта реакция позволяет обнаружить возбудителя в течение нескольких минут при концентрации в исследуемом материале не менее 105 микробных клеток в 1 мл. Для постановки РИВ на предметное стекло наносят 2 капли исследуемого материала. Первая капля служит контролем, ее накрывают
32
покровным стеклом. Вторая капля является опытной. К ней добавляют каплю холерной О1 или О139 сыворотки, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленные капли просматривают под микроскопом. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов в первой капле наблюдается характерная подвижность, а во второй капле отмечается иммобилизация микробных клеток. РИВ позволяет дать ответ через 15-20 минут.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) проводится с использованием антительного эритроцитарного холерного диагностикума. РНГА позволяет дать ответ о наличии специфического антигена уже через 2-3 часа.
Принадлежность холерных вибрионов к О1 или О139 серогруппе определяют в реакции слайд-агглютинации (реакции агглютинации на стекле) или в развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками О1, Инаба, Огава, и О139. В последние годы в идентификации холерных вибрионов используют новые серологические методы: реакцию коагглютинации (РКОА) и реакцию агглютинации объемную (РАО).
Реакция коагглютинации (РКОА) проводится на стекле с помощью диагностикумов, коагглютинирующих О1 и О139 холерные вибрионы. Эти диагностикумы представляют собой препараты, содержащие белок А стафилококков, сенсибилизированный кроличьими О1 и О139 холерными сыворотками. Холерные антитела, сорбированные на стафилококковом белке, при соединении с холерными антигенами вызывают реакцию коагглютинации.
Реакция агглютинации объемная (РАО) используется для выявления липазной активности холерных вибрионов с целью дифференциации гемолитических (атоксигенных) и негемолитических (токсигенных) штаммов V. cholerae eltor, выделенных из окружающей среды. РАО проводится в планшетах с использованием полимерного антилипазного иммуноглобулинового диагностикума. Диагностикум выпускается в комплекте с нормальной кроличьей сывороткой.
Определение антител в крови больных (серологическая диагностика холеры) носит вспомогательный характер. Серологическое обследование позволяет подтвердить диагноз в случае атипичного течения заболевания, а также является важным методом ретроспективной диагностики холеры. Для серологической диагностики используют методы, позволяющие выявлять в сыворотке крови больных, вибриононосителей, реконвалесцентов, вакцинированных лиц специфические антитела (агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела). Специфические агглютинины к холерным вибрионам серогруппы О1 выявляют путем постановки объемной реакции агглютинации (РА), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антигенным поливалентным О1 холерным диагностикумом, реакции нейтрализации антигена (РНАг) с иммуноглобулиновым холерным диагностикумом. Антитоксины к холерным вибрионам серогрупп О1 и О139 выявляют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием энтеротоксического холерного диагностикума. Вибриоцидные антитела обнаруживают с помощью реакции вибриоцидных антител (РВА).
33
Иммунитет
Постинфекционный иммунитет при холере непродолжительный. Иммунитет носит антитоксический и антимикробный характер, обусловлен антителами, клетками иммунной памяти и фагоцитами. При этом антитоксические антитела сохраняются в организме дольше, чем антимикробные антитела.
У больных холерой специфические антитела выявляются на 5-7 день от начала заболевания. Основная роль в иммунитете против холеры принадлежит антителам, продуцируемым местно (на слизистой оболочке кишечника). Антимикробные иммуноглобулины А слизистых оболочек блокируют лиганды на поверхности микробных клеток и препятствуют прилипанию вибрионов к энтероцитам. В результате этого снижается способность холерных вибрионов к адгезии и колонизации, что приводит к быстрому выведению возбудителя из организма при перистальтике кишечника.
Антитоксические антитела взаимодействуют с В-субъединицей экзотоксина, в результате чего блокируют связывание холерогена с рецептором Gm1 на поверхности энтероцитов.
Лечение холеры
При подозрении на холеру больных госпитализируют в специализированное отделение. Лечение больных холерой должно начинаться с восстановления нормального водно-солевого обмена (симптоматическое лечение). С этой целью рекомендуется использовать солевые растворы, содержащие хлорид натрия, бикарбонат натрия, глюкозу. Жидкости вводят как перорально, так и парентерально, внутривенно. Количество вводимого солевого раствора определяют с помощью специальных формул с учетом относительной плотности плазмы и концентрации калия в ней. Потери жидкости определяют, собирая рвотные массы и испражнения в специальную мерную посуду. Для этого больного помещают на так называемую
отверстие на уровне ягодиц больного, а
Кровати для холерных больных |
специальных носилках (рисунок 34). |
К р о в а т и д л я х о л е р н ы х б о л ь н ы х |
|
Рисунок 34 – “Холерная” кровать и носилки для транспортировки больного холерой.
34
Симптоматическое лечение солевыми растворами дополняют антибиотикотерапией, что позволяет снизить летальность при холере до 1% и менее. Из антибиотиков используют препараты тетрациклинового ряда (тетрациклин, доксициклин), фторхинолоны (ципрофлоксацин, ломефлоксацин, офлоксацин), эритромицин, левомицетин (хлорамфеникол).
Профилактика холеры
Профилактика холеры складывается из неспецифических и специфических мероприятий. К мерам неспецифической профилактики холеры относятся санитарно-гигиенические мероприятия, предупреждающие занос заболевания; санитарно-просветительная работа среди населения; раннее выявление больных и бактерионосителей; карантинные мероприятия. Особое внимание уделяется снабжению населения качественной питьевой водой, хлорированию воды, соблюдению санитарно-гигиенического режима на пищевых предприятиях, в детских учреждениях, общественных местах. Осуществляется строгий бактериологический контроль воды в открытых водоемах.
Экстренная профилактика холеры проводится путем массового профилактического назначения тетрациклина в районах эпидемической опасности. С этой же целью используют и другие антибиотики, эффективные против V. cholerae.
Специфическая профилактика холеры включает вакцинацию населения по эпидемическим показаниям (вакцинация населения в эпидемических районах или вакцинация людей, выезжающих в неблагополучные по холере регионы). Эффективность применения вакцин не превышает 60-70%, невосприимчивость после вакцинации сохраняется в течение 3-8 месяцев.
В настоящее время имеются следующие пероральные противохолерные вакцины:
-вакцина WC/BS состоит из инактивированных клеток V. cholerae серогруппы О1 с добавлением очищенной В-субъединицы холерного анатоксина. Вакцина обеспечивает защиту в течение шести месяцев после подкожного введения двух доз с недельным интервалом;
-модифицированная вакцина WC (убитая корпускулярная холерная вакцина) состоит только из инактивированных холерных вибрионов и не содержит В-субъединицы холерного анатоксина. Применяется две дозы с недельным интервалом. Убитые корпускулярные вакцины готовятся на основе вирулентных
штаммов холерного вибриона классического биотипа или биотипа Эль-Тор сероваров Инаба и Огава, выращенных при температуре 37ОС в течение 18-20 часов
иинактивированных нагреванием (54ОС в течение 1 часа) или формалином. Препараты выпускают в жидком или лиофилизированном виде.
-вакцина CVD 103-HgR состоит из ослабленных живых генетически модифицированных штаммов V. cholerae серогруппы О1. Штамм CVD 103HgR получен путем делеции гена субъединицы А холерного токсина и включения в
ген гемолизина маркера устойчивости к ртути. Однократная вакцинация
35
обеспечивает защиту в течение 3-6 месяцев.
При создании живых противохолерных вакцин особое внимание уделяют не только иммуногенности и ареактогенности, но и безопасности препаратов. Под безопасностью подразумевают невозможность повторного приобретения вакцинными штаммами факторов вирулентности спонтанно или в результате горизонтального переноса генов от диких штаммов с помощью бактериофага СТХφ in vivo.
Препараты для перорального использования предпочтительнее, так как обеспечивают развитие местного иммунитета в слизистой оболочке тонкого кишечника.
В нашей стране разработана холерная вакцина на основе холерогенаанатоксина. Препарат представляет собой смесь обезвреженных формалином экзотоксина и О-антигена холерного вибриона серовара Инаба. Холерогенанатоксин получают путем культивирования холерных вибрионов в жидкой питательной среде. В последующем экзотоксин отделяют от бактериальных клеток центрифугированием, очищают сульфатом аммония и обезвреживают формалином. Вакцину выпускают как в жидком, так и в сухом виде. Жидкий препарат анатоксина представляет собой раствор желтовато-коричневого цвета с небольшой опалесценцией. Сухой препарат холерогена-анатоксина представляет собой пористую массу серовато-желтого цвета. Холероген-анатоксин предназначен для создания искусственного активного иммунитета против холеры по эпидемическим показаниям. Применяется однократно.
Вопросы для самоконтроля усвоения материала
1.История изучения холеры и открытия возбудителя заболевания.
2.Таксономическое положение возбудителя холеры.
3.Морфологические и тинкториальные свойства холерного вибриона.
4.Биохимическая активность возбудителя холеры.
5.Культуральные свойства холерного вибриона.
6.Антигенная структура холерного вибриона.
7.Факторы патогенности возбудителя холеры.
8.Эпидемиология холеры.
9.Патогенез холеры.
10.Клиническая картина холеры.
11.Микробиологическая диагностика холеры.
12.Принципы лечения холеры.
13.Профилактика холеры.