46
2.Ферментативная активность. Ферментацию углеводов и спиртов определяют в жидких средах Гисса с индикатором Андреде. Среды Гисса содержат пептон (10 г), натрия хлорид (5 г), углевод (5-10 г), индикатор Андреде (10 мл), дистиллированную воду (1000 мл). Состав индикатора Андреде: фуксин – 1 г, 1 N раствор натрия гидроксида – 64 мл, дистиллированная вода – 400 мл. Для выявления газообразования в среды помещают поплавки (маленькие трубочки, запаянные с одного конца). Готовые жидкие среды Гисса с индикатором Андреде имеют соломенно-желтый цвет. В приготовленные среды вносят исследуемую культуру и инкубируют при температуре 37ОС в течение 18 часов. Расщепление углеводов и спиртов холерным вибрионом сопровождается образованием кислоты без газа и изменением рН, в результате чего цвет среды становится ярко-розовым.
3.Определение типа расщепления глюкозы (тест Хъю-Лейфсона). Для изучения способности холерного вибриона расщеплять глюкозу в аэробных и анаэробных условиях используют среду Хью-Лейфсона. Изучаемую культуру засевают уколом в столбик в две пробирки со средой Хью-Лейфсона. После посева в
одну из пробирок вносят 0,5-1 мл стерильного вазелинового масла для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при температуре 37ОС в течение 1-4 суток. Ферментацию глюкозы холерным вибрионом как в аэробных, так и анаэробных условиях выявляют по изменению окраски среды в желтый цвет.
4.Реакция Фогеса-Проскауэра. Исследуемую культуру высевают в среду Кларка и инкубируют при температуре 37ОС в течение 1-3 суток. К 1 мл выросшей
культуры добавляют 0,6 мл 6%-ного спиртового раствора а-нафтола и 0,4 мл 40%- ного раствора едкого калия. Пробирки встряхивают и инкубируют при 37ОС в течение 1 часа. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или ярко-красный цвет.
5.Образование индола. Холерные вибрионы при выращивании в средах (пептонная вода, МПБ), обогащенных триптофаном (0,01%), расщепляют его с
образованием индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек после инкубирования при температуре 37ОС в течение 18 часов. Индикаторные бумажки представляют собой полоски фильтровальной бумаги, пропитанные насыщенным раствором щавелевой кислоты. Верхний конец сухой индикаторной бумажки фиксируют пробкой. Нижний конец бумажки не должен соприкасаться со средой. При образовании индола (положительная проба) нижний конец бумажки приобретает интенсивный розовый цвет. При отрицательной реакции бумажка сохраняет кремово-желтый цвет.
6.Образование сероводорода. Холерные вибрионы не продуцируют фермент тиосульфатредуктазу и не способны расщеплять неорганические серосодержащие соединения, присутствующие в среде Клиглера. Посев культуры
вначале проводят по скошенной части в виде прямой линии, а затем уколом в толщу столбика среды. Посевы инкубируют при температуре 37ОС в течение 18-24 часов.
7.Определение гемолитической активности вибрионов по Грейгу. Для исследования используют 18-24-часовую культуру возбудителя, выращенную в МПБ. К 1 мл бульонной культуры добавляют равное количество 1%-ной взвеси
отмытых эритроцитов барана в растворе натрия хлорида. Полученную смесь осторожно перемешивают, помещают на 2 часа в термостат при температуре 37ОС, а затем на сутки в холодильник. При положительной реакции отмечается лизис
47
эритроцитов (лаковая кровь). В контрольной пробирке (взвесь эритроцитов в бульоне) гемолиз отсутствует.
8.Реакция агглютинации проводится либо на стекле (слайдагглютинация), либо в пробирке (развернутая реакция агглютинации). В реакции слайд-агглютинации на обезжиренное стекло наносят каплю диагностической сыворотки, в которую добавляют исследуемую культуру. В качестве контроля используют взвесь культуры в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Положительная реакция проявляется через несколько минут образованием хлопьев агглютината.
9.Метод флюоресцирующих антител (МФА). Используется для ускоренной идентификации возбудителя в нативном материале, в материале после подращивания и в чистой культуре. Позволяет выявлять возбудители холеры серогрупп О1 и О139. Приготовленные мазки обрабатывают флюоресцирующими диагностическими холерными адсорбированными лошадиными иммуноглобулинами. Положительный результат проявляется через 1,5-2 часа специфическим свечением характерных по морфологии микробов.
10.Реакция иммобилизации вибрионов (РИВ). Позволяет обнаружить
возбудителя в течение нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не менее 105 микробных клеток в 1 мл. Для осуществления реакции на предметное стекло наносят 2 капли исследуемого материала. К одной капле (опыт) добавляют каплю сыворотки серогруппы О1. Обе капли накрывают покровными стеклами и микроскопируют с фазово-контрастным устройством. При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой (контрольной) капле наблюдают характерную подвижность, а во второй капле - иммобилизацию микробных клеток и образование через 1-2 минуты неподвижных микроагглютинатов. Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать предварительный ответ через 15-20 минут от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате используют холерную сыворотку серогруппы 0139.
11.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). При постановке РНГА используют диагностикум эритроцитарный холерный иммуноглобулиновый. Постановку реакции проводят в соответствии с Инструкцией по применению диагностикума.
12.Определение антибиотикочувствительности. При определении чувствительности культур холерного вибриона к антибиотикам применяют стандартный диско-диффузионный метод. При этом используют диски, пропитанные фторхинолонами (ципрофлоксацин, офлоксацин, ломефлоксацин), левомицетином, рифампицином, тетрациклином (доксициклином).
13.Определение чувствительности культур к диагностическим холерным фагам. В работе используют диагностические холерные бактериофаги - классический и эльтор. Определение чувствительности культур к фагам проводят как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями. Исследование проводят с использованием щелочного агара. Дно чашки с агаром делят на квадраты
по количеству образцов фагов с учетом разведений. В пробирку с 5 мл 0,5-0,7% агара, расплавленного и охлажденного до 45ОС, добавляют 0,1-0,2 мл бульонной культуры, быстро перемешивают и выливают на поверхность агара. Через 30 минут
вцентр каждого квадрата наносят по капле суспензии бактериофагов и их
48
разведений. После подсыхания капель чашки переворачивают вверх дном и инкубируют при температуре 37ОС в течение 18-20 часов. Положительный результат проявляется в виде одного стерильного пятна или группы негативных колоний на месте нанесения капли бактериофага.
14.Определение чувствительности к полимиксину В. В расплавленный и остуженный до 45ОС агар вносят полимиксин В до конечной концентрации 50 ед./мл. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. На
поверхность агара петлей высевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при температуре 37ОС в течение 18 часов. На агаре с полимиксином В холерные вибрионы классического биовара не растут, а для вибрионов биовара эльтор этот признак является положительным.
15.Реакция гемагглютинации. На предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и суспендируют в ней петлей агаровую культуру. Затем
ксуспензии добавляют каплю 2,5%-ной взвеси отмытых куриных эритроцитов. Положительная реакция проявляется склеиванием эритроцитов в течение 1 минуты. В качестве контролей служат взвесь эритроцитов в физиологическом растворе и суспензия культуры в физиологическом растворе.
16.Реакция коагглютинации (РКОА). На предметное стекло наносят две капли взвеси холерных вибрионов в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. В одну из них добавляют каплю коагглютинирующего диагностикума (опыт), в другую – каплю 0,9%-ного раствора хлорида натрия (контроль). Через 2-3 минуты производят учет результатов на темном фоне. Положительная реакция проявляется в виде полной агглютинации с просветлением жидкости при отсутствии агглютинации в контроле.
17.Реакция агглютинации объемная (РАО). Реакция проводится в полистироловых планшетах. В 3 лунки вносят по 50 мкл 1%-ного раствора нормальной кроличьей сыворотки. В первую лунку добавляют 50 мкл исследуемой бульонной культуры и переносят 50 мкл во вторую лунку, а из второй – в третью лунку. Из третьей лунки 50 мкл удаляют. Затем во все лунки добавляют по 1 капле (25 мкл) диагностикума, содержимое лунок перемешивают покачиванием планшета в течение 1 минуты и оставляют на 2,5 часа при комнатной температуре. В качестве контролей используют ряды лунок, в которые добавляют культуры гемолитичного (атоксигенного) штамма холерного вибриона, негемолитичного (токсигенного) штамма холерного вибриона или МПБ. Положительный результат проявляется в виде ярко-розового агломерата, выстилающего дно лунки равномерным слоем (зонтик). Положительная реакция указывает на продукцию липазы и свидетельствует о гемолитической активности холерного вибриона. При отрицательном результате образуется компактный осадок в центре лунки (пуговка).
18.Методика выявления агглютининов в крови больного в реакции агглютинации (РА). Исследуемую сыворотку титрую в 1%-ной пептонной воде в пробирках от 1:10 до 1:640. В пробирки с титрованной сывороткой вносят по 1
капле бульонной культуры холерного вибриона. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37ОС, а затем на 18-24 часа в холодильник. Положительный результат проявляется агглютинацией культуры. Титр агглютининов выражается разведением сыворотки.
19.Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови на основе
49
чашечного метода (Finkelstein). В 5-10 пробирок разливают по 0,9 мл комплемента, разведенного 1:20 раствором хлорида натрия. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и тщательно перемешивают. После этого последовательно переносят по 0,1 мл из одной пробирки в следующую, получая десятикратные разведения. Титрование сыворотки проводят на льду. Затем в пробирки с титрованной сывороткой вносят по 0,1 мл взвесь односуточной агаровой культуры холерного вибриона. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37ОС. После этого пробирки вновь помещают в лед и из каждой пробирки по 0,1 мл культуры высевают на чашки с щелочным агаром. Шпателем суспензию равномерно распределяют по поверхности агара. Чашки инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 37ОС, после чего подсчитывают количество выросших колоний. Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее 50% клеток холерного вибриона.
20. Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови на основе ферментации углеводов. В 5-10 пробирок разливают по 0,45 мл комплемента, разведенного 1:20 1%-ной пептонной водой с сахарозой и индикатором Андреде. Пробирки помещают на лед. В первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и тщательно перемешивают. После этого последовательно переносят по 0,05 мл из одной пробирки в следующую, получая десятикратные разведения. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии агаровой культуры холерного вибриона. Пробирки помещают в термостат (37ОС) на 5-6 часов, после чего учитывают результаты. Красный цвет содержимого пробирок связан с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами и свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За титр вибриоцидных антител принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизмененным.
21. Определение вибриоцидных антител с использованием холерного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума (РПГА). В 10 лунок планшеты разливают по 0,9 мл комплемента, разведенного 1:20 1%-ной пептонной водой. В первую лунку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и титруют ее переносом по 0,1 мл из лунки в лунку. Из последней лунки 0,1 мл разведения сыворотки выливают. Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл взвеси холерных вибрионов. Планшету помещают в термостат при 37ОС. После этого во все лунки добавляют по одной капле 10%-ного раствора формалина. Через час после добавления формалина во все лунки вносят по 1 капле иммуноглобулинового холерного эритроцитарного диагностикума. Содержимое лунок осторожно перемешивают покачиванием планшеты. Через 2-3 часа выдерживания планшеты при комнатной температуре учитывают результаты реакции. За вибриоцидный титр принимают наибольшее разведение сыворотки с отсутствием гемагглютинации в лунке.
Учебная и методическая литература
1. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии:
50
Учебное пособие для студентов медицинских вузов / Под ред. А.А. Воробьева, А.С. Быкова – М.: Медицинское информационное агентство, 2003. – 236 с.: ил.
2.Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: М:
ООО“Медицинское информационное агентство”, 2002. – 736 с.
3.Воробьев А.А. Медицинская и санитарная микробиология: учеб. пособие для студ. высш. мед. учеб. заведений / А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин, В.П. Широбоков. – 2-е изд., стер. – М.: Издательский центр “Академия”, 2006. – 464 с.
4.Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник / В.И. Покровский, С.Г. Пак, Н.И. Брико, Б.К. Данилкин. – 2-е изд. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 816 с.: илл.
5.Кондрашова З.Н., Сергеев А.Г., Козлов А.П., Голиков В.Ф., Мамаев И.Л. Грамотрицательные бактерии. Медицинский Вестник - Журнал для студентов и врачей. Челябинск, 2002.-№ 7 (108). - 60с.
6.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.
7.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов. – 3-е изд., испр. и доп. – СПб.: СпецЛит, 2002.
– 591 с.: ил.
8.Медицинская микробиология / Под ред. В.И. Покровского. – М.: ГЭОТАРМЕД, 2002. – 768 с.
9.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.
10.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.
11.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.
12.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.
13.Методические указания. МУК 4.2.2218-07. Лабораторная диагностика
холеры.
14.Методические указания МУК 4.2.2315-08. Серологические методы в диагностике холеры. Дополнение к МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры.
15.Методические указания. МУК 4.2.2870-11. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней.
16.Мотавкина Н.С., Артемкин В.Д. Атлас по микробиологии и вирусологии. М.: Медицина, 1976. – 307 с.: ил.