Для оптимизации и управления биотехнологическими процессами, помимо экспериментального, необходимо также привлечение математического моделирования. Эти два подхода, дополняя друг друга, позволяют более эффективно решать поставленные задачи. Экспериментальное моделирование часто предшествует математическому, являясь для него источником информации. Математические модели – удобное средство обобщения экспериментальных данных. Наличие математических моделей позволяет более обоснованно подходить к планированию экспериментов и обрабатывать данные, существенно сокращать объем экспериментальных работ. Для моделирования и расчета биотехнологических процессов в силу их сложности применяют системный подход. Математическая модель сложной биосистемы должна включать описание различных по своей природе объектов и явлений. Поэтому, анализируя биологическую системы в целом, применяют метод декомпозиции, расчленяя исходную систему на ряд подсистем: строятся модели массообмена, кинетики роста биообъекта и биохимических процессов. К настоящему времени разработано много моделей массообмена, кинетики потребления субстрата и образования различных продуктов. Наиболее сложная задача – моделирование собственно биологических объектов, так как они значительно сложнее химических, физических и технических. Объекты биотехнологии способны к саморегулированию, их сложность усугубляется неоднородностью. Процессы, протекающие в биореакторе, зависят не только от сложных внутриклеточных факторов, но и от условий внешней среды; в свою очередь, внешние процессы в биологии связаны с внутренними, поэтому их разделить нельзя. Кроме этого, на данном этапе уровня развития математической биологии отсутствует теория, адекватная сущности биологических процессов. Пока не создан математический аппарат, способный описать природу биологических превращений во всем многообразии, то есть необходимо развитие и совершенствование самого математического аппарата. Математическое описание биологических объектов дополнительно осложняется их недостаточной изученностью. Поэтому на данном этапе возможно достаточно упрощенное и приближенное математическое описание биологических объектов, это направление нуждается в существенном совершенствовании.
Координация микробного метаболизма
В живых клетках протекает огромное число реакций, необходимых для роста, размножения и поддержания их жизнедеятельности. Большинство этих реакций носит ферментативный характер и протекает в присутствии специфических ферментов. Для нормального функционирования клетки необходима согласованность протекания всех реакций во времени и в пространстве. В каждый момент должны образовываться и действовать ферменты, которые катализируют реакции, нужные в данный момент развития клетки.
Практически все гены у бактерий функциональные, а у эукариот 2/3 не функциональные. Белок у бактерий синтезируется сразу весь и включается в метаболизм, а у эукариот образуются экзоны и интроны.
Координация микробного метаболизма осуществляется с помощью следующих механизмов регуляции:
1. Индукция синтеза ферментов;
2. Репрессия синтеза ферментов;
3. Ингибирование активности ферментов;
4. Активизация ферментов.
Первые два механизма обеспечивают регуляцию путем изменения концентрации того или иного фермента в клетке, вторые два — путем изменения активности уже имеющихся ферментов. Остановимся на каждом механизме подробнее.
Индукция синтеза ферментов
Все ферменты микробных клеток можно разделить на две группы:
1. Конструктивные
2. Индуцибельные.
К первой относятся ферменты, которые всегда имеются в клетке, независимо от фазы её развития и условий окружающей среды. Это ферменты, катализирующие наиболее важные метаболические реакции, например, катаболизм глюкозы.
Вторая группа включает ферменты, которые синтезируются лишь в определенных условиях, при наличии в среде вещества — индуктора. Чаще всего ин-дуктором синтеза фермента является его специфичный субстрат, но иногда может быть и другое вещество. Механизм индукции не позволяет транжирить энергию и питательные вещества на синтез ненужных, в данных условиях, ферментов.
Например, если клетки бактерий растут на среде с глюкозой, они почти не синтезируют амилолитические ферменты, однако при переносе на среду, где единственным источником углерода и энергии является крахмал, происходит индукция синтеза амилаз, необходимых для усвоения крахмала.
Наиболее подробно изучен механизм индукции синтеза ферментов (катаболизм лактозы) у Е.сoli.
Три гена, кодирующие аминокислотную последовательность трех ферментов катаболизма лактозы (В-галактозидазы, лактопермеазы и трансацетилазы), расположены в хромосоме последоватеьно и образуют совместно с промоторной и операторной областью lac-оперон.
В начале оперона, перед структурными генами, расположены регуляторный участок молекулы ДНК, состоящий из промотора и оператора.
Промотр - это участок, к которому присоединяется РНК- полимераза (начало синтеза м-РНК).
Оператор – это участок, с которым связывается специальный белок - репрессор.
Синтез репрессора, в свою очередь, кодируется геном - регулятором. Белок - репрессор содержит два активных центра - один обеспечивает присоединение белка к оператору, а другой обладает сродством с молекулами индуктора.
В отсутствие индуктора белок - репрессор прочно связывается с оператором. Это препятствует продвижению РНК-полимеразы по нуклеотидной цепочке ДНК и блокирует транскрипцию структурных генов и синтез соответствующих ферментов. При наличии индуктора (для lac - оперона - это не сама лактоза, а аллолактоза) он (индуктор) специфично присоединяется к репрессору и изменяет его конформацию, что приводит к снижению сродства репрессора к оператору и освобождению оператора. Снимается блокировка продвижения РНК-полимеразы, начинаются транскрипция структурных генов и синтез ферментов.
Описанный выше механизм индукции, при котором один индуктор вызывает синтез нескольких ферментов одного метаболического пути, называют координированной индукцией. Наряду с ней в клетках микроорганизмов действуют системы последовательной индукции. При этом длина цепочки индуцируется своим собственным субстратом (субстратом для первого фермента в цепочке).
Репрессия синтеза ферментов - это процесс, осуществляющийся по принципу обратной связи. Это означает, что конечный продукт цепи биохимических реакций подавляет синтез действия фермента, катализирующего первую реакцию цепи. Подобный механизм обеспечивает равновесие между скоростями синтеза низкомолекулярных соединений и их расходования на построение биополимеров и исключает непродуктивные затраты веществ и энергии на образование излишних количеств промежуточных продуктов.
Репрессия - подавление синтеза ферментов осуществляется следующим образом. Регуляторный ген R кодирует синтез белка-репрессора (анорепрессора), который в свободном состоянии неактивен, но может быть активирован корепрессором, который и является конечным продуктом цепи биохимических превращений.
Активированный белок-репрессор связывается с геном-оператором О, что препятствует считыванию информации со структурного гена R и, следовательно, синтезу соответствующего фермента. В отсутствие корепрессора синтез фермента происходит беспрепятственно.
Если мы добавим в питательную среду какой-либо индуктор целевого вещества,то происходит сверхсинтез этого вещества, в количествах, многократно превышающих потребности самой клетки. Это явление широко используется на практике при производстве биологически активных веществ (аминокислот, витаминов, ферментов)
Ферменты, у которых легко регулируется активность, относятся к регуляторным. Они, как правило, построены из нескольких субъединиц, чаще всего из четырех. Кроме каталитических центров, распознающих и связывающих субстраты, у регуляторных ферментов есть и другие стереоспецифические центры. Это места связывания эффекторов, изменяющих сродство фермента к субстрату. У ферментов имеются особые участки - для связывания отрицательных эффекторов (ингибиторов). Происходит ингибирование или снижение активности ферментов. При связывании положительных эффекторов (активаторов) поисходит активация активности ферментов.
Регуляторные ферменты, как правило, имеются в каждом пути биосинтеза и в некоторых путях катаболизма. В большинстве случаев они находятся в начале цепи биосинтеза и занимают, таким образом, ключевую позицию.
Аллостерические эффекторы представляют собой низкомолекулярные соединения - это либо конечные продукты биосинтеза, либо вещества, концентрация которых может отражать состояние клеточного метаболизм, например АТФ, АДФ, АМФ, ацетил.
Методы извлечения БАВ из растительного сырья являются основным вопросом при разработке и изготовлении БАД к пище на основе растительного сырья. От реализации отработанной технологии зависит количество извлекаемых из сырья БАВ и их состав, себестоимость полученной субстанции и соответственно изготовленного на ее основе препарата.
Экстракция БАВ из сухого растительного сырья осуществляется водно-спиртовым раствором, водой, углекислотой, фреоном и рядом других экстрагентов. Различные экстрагенты используются для извлечения различных групп веществ.
Так, для извлечения флавоноидов и алкалоидов используется водно-спиртовый раствор. Для извлечения жирорастворимых компонентов используются неполярные экстрагенты (углекислота, фреон, масла). Основная часть сухого растительного сырья экстрагируется в промышленности водно-спиртовой смесью. Водные экстракты из растительного сырья имели ограниченное применение из-за невысокой устойчивости водных растворов БАВ к различным воздействиям (микробиологическим, окислительным и др.).
При разработке методов водного извлечения БАВ для конкретного сырья обязательным условием является обеспечение условий интенсивной и кратковременной экстракции в безокислительных условиях. Надо увеличить образуемые при сушке сырья поры в мембране клетки или нарушение ее целостности. Основным приемом стабилизации экстрактов является их концентрирование. Густые экстракты стерилизуются в скребковых стерилизаторах для использования в приготовлении некоторых форм БАД или используются как сырье для получения сухих экстрактов в вакуумных сушилках барабанного типа.
Субстанции из свежего сырья. При сушке растительного сырья 15-25% БАВ разрушается. Клетки свежего сырья обладают значительным тургором, механическими нагрузками сравнительно легко разрушается оболочка клетки, водой «вымывается» ее содержимое. Это так называемая диффузионная экстракция. Такая экстракция обеспечивает не только более полное извлечение БАВ, но в значительной степени позволяет сохранить природный комплекс биологически активных веществ. Полученный экстракт концентрируется и стерилизуется. При реализации технологии существенную роль играет способ деструкции сырого сырья, организация механических воздействий на сырье таким образом, чтобы разрушить оболочку клетки, но не измельчать сырье до микронных размеров. При тонком измельчении возникает не только проблема отделения экстракта от шрота, но значительно усложняется вакуумная концентрация экстрактов, содержащих тонко измельченную клетчатку, вследствие повышенной вязкости экстракта и его малой теплопроводности. Извлечение БАВ из свежего растительного сырья не является тривиальной задачей и решается для каждого вида сырья с оптимизацией расходов на субстанцию.
Вакуумное концентрирование экстрактов осуществляется на разработанных вакуумных выпарных аппаратах с возможностью оперативного отбора концентрата и контроля содержания сухих веществ. Пять выпарных аппаратов с общей производительностью около 2 тонн выпаренной влаги в час позволяют оперативно настраиваться на объемы получаемых экстрактов и осуществлять одновременно концентрацию экстрактов различных видов сырья.
Стерилизация густых экстрактов. Для густых концентратов, обладающих низкой теплопроводностью и наоборот большой вязкостью пригодны только скребковые стерилизаторы. Густые экстракты различных видов сырья значительно отличаются по своим физико-химическим свойствам и режимы их стерилизации заметно отличаются. Скребковый стерилизатор позволяет регулировать скорость подачи и температуру пара в теплообменнике, скорость вращения скребков и объем подаваемого в стерилизатор густого экстракта.
Сухие экстракты получаются в вакуумных сушилках барабанного типа совмещенной с шаровой мельницей с объемом загрузки 200-300 литров густого экстракта.
Из органоминерального сырья биологически активные вещества извлекаются сложными многокомпонентными экстрагентами. Подготовка сырья, экстрагента и его рекуперация не относятся к тривиальным операциям. В то же время от подготовки сырья и соотношения компонент экстрагента зависит не только количество, но и качество извлекаемых веществ
В России биопрепаратами называют препараты, полученные на основе штаммов микроорганизмов, имеющих разрешения санитарно-эпидемиологических служб на их производство и применение. Подавляющее большинство этих штаммов прототрофные, природного происхождения, т. е. не относятся к генетически модифицированным и не содержат мутаций, требующих дополнительных источников ростовых факторов.
Товарной формой препаратов могут быть сухой порошок и жидкая концентрированная суспензия клеток. Технология получения сухих товарных форм биопрепаратов и используемое технологическое оборудование типичны для биотехнологических процессов получения биомассы живых клеток микроорганизмов (например, при выпуске пекарских дрожжей, микробиологических средств защиты растений и т. д.). Технология включает следующие стадии:
* прием, хранение и подготовка сырья, органического субстрата, растворов минеральных солей;
* обеспечение ферментационного процесса источником кислорода, технологической водой, паром, моющими и дезинфицирующими средствами, пеногасителями;
* выращивание посевного материала;
* накопление биомассы в рабочем аппарате - ферментере;
* концентрирование суспензии микроорганизмов сепарацией, микрофильтрацией, адсорбцией на инертных материалах-наполнителях;
* сушка (при выпуске жидких форм препаратов стадия сушки отсутствует);
* если предусмотрено, гранулирование, компаундирование препарата с различными наполнителями и внесение добавок;
* расфасовка, упаковка, складирование, отправка готового продукта;
* очистка сточных вод, газовоздушных выбросов со стадии ферментации, сепарации и сушки.
На стадии ферментации микроорганизмы культивируют периодическим или непрерывным способом, на питательных субстратах и при режимах, гарантирующих получение микроорганизмов с необходимыми свойствами или активностью ферментов, участвующих в удалении загрязнений. При использовании таких субстратов, как углеводороды, биодоступные аналоги ксенобиотиков (например, нехлорированные аналоги хлорсодержащих соединений) возможно культивирование в не строго асептических условиях, что существенно упрощает требования к технологическому обеспечению ферментационного процесса и квалификации обслуживающего персонала.
При концентрировании биомассы и сушке используются методы и технологические режимы, обеспечивающие сохранение жизнеспособных клеток микроорганизмов, что особенно важно при получении биопрепаратов на основе неспоровых форм микроорганизмов. В частности, сепараторы и циркуляционные контуры мембранных установок оснащаются рубашкой для охлаждения суспензии, что позволяет в процессе сепарирования поддерживать температуру ниже температуры инактивации клеток микроорганизмов, для сушки применяют распылительные, лиофильные или вакуум-термические сушилки.
При получении иммобилизованных биопрепаратов суспензию клеток микроорганизмов (обычно до стадии концентрирования) смешивают с носителем (сорбентом). Носитель может быть порошкообразным, гранулированным, волокнистым, тканым. Процедура иммобилизации может предусматривать внесение дополнительных реагентов, флокуляцию, осаждение клеток на носителе и другие приемы, повышающие эффективность иммобилизации. В процессе созревания, длящемся от 2-3 недель до 1,5-2 месяцев, биомасса микроорганизмов-деструкторов нарастает на носителе, увеличиваются титр жизнеспособных клеток, их активность и срок хранения препарата.
Внесение различных добавок (наполнителей, осмопротекторов и других защитных веществ, компонентов питания и т. п.) в полученную биомассу позволяет исключить из технологической схемы стадию сушки, инактивирующую клетки микроорганизмов, стандартизировать характеристики биопрепарата, увеличить срок хранения, выживаемость и активность микроорганизмов, эмульгирующую, диспергирующую, адгезионную, пенообразующую способности, уменьшить слеживаемость.
Сухие товарные формы биопрепаратов могут храниться до 6 месяцев и более без существенного снижения их целевых свойств. Срок хранения жидких препаратов существенно ниже. Однако исходный титр жизнеспособных клеток в них может быть больше, а стоимость ниже, так как из технологии получения исключена стадия сушки, приводящая к инактивации части клеток.