Существует несколько методик для реализации этой реакции - преципитация в геле (агаре), кольцепреципитация, иммунофорез.
По своей сущности реакция преципитации аналогична реакции агглютинации. Основным различием между ними является то, что в реакции агглютинации участвует корпускулярный антиген, а в реакции преципитации - растворимыйантиген.
Реакция преципитации используется для определения токсигенности дифтерийных бактерий, концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке (реакция Манчини).
К сложным реакциям иммунитета относятся:
1. Реакция связывания комлемента (РСК) - сложная, многокомпонентная непрямая реакция иммунитета. В ней участвуют две системы: исследуемая, состоящая из антигена и антитела (один из них неизвестен), и индикаторная, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним, а также комплемент.
Если в исследуемой системе антиген и антитело соответствуют друг другу, они образуют комплекс, и этот комплекс связывает комплемент. В этом случае в индикаторной системе изменений не произойдет и эритроциты осядут на дно пробирки.
Если же в исследуемой системе антиген и антитело не соответствуют друг другу, комплекс антиген-антитело не образуется, и комплемент остается свободным. В этом случае он обуславливает гемолиз эритроцитов индикаторной системы.
РСК не имеет ограничений по природе антигенов и широко используется как для серодиагностики бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, так и для индикации их антигенов.
Для индикации антигенов широко используются реакции иммунитета с меченными компонентами (чаще иммунными сыворотками). Это экспресс-методы индикации. Они являются очень чувствительными и высокоспецифичными. К ним относятся: РИФ, РИА, ИФА, ИХА и т.д.
2. Радиоиммунный анализ (РИА) - основан на использовании меченных, например, радиоактивным йодом 125I, 131I или радиоактивным водородом H2, антител.
Образующийся комплекс антиген-антитело содержит радиоактивную метку и легко обнаруживается с помощью соответствующих приборов (радиометров). При этом можно измерить не только наличие радиоактивности, но и ее интенсивность.
РИФ, ИФА, ИХА смотреть № 52.
56. Серодиагностика. Реакции иммунитета, применяемые для серодиагностики
Серодиагностика - метод диагностики, с помощью которого в сыворотке обследуемого обнаруживают антитела и нарастание их титра.
Реакции иммунитета - взаимодействие антигена и антитела - характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, т.е. в реакцию вступают только соответствующие друг другу антиген и антитело.
Для реализации этого метода используют различные реакции иммунитета:
- Простые (агглютинация и ее разновидности)
- Сложные (РСК, ИФА и др.)
Подробнее о реакциях см. 52 и 55
Этот тип реакций можно представить в виде следующего равенства ? АГ + хАТ = результат.
Нарастание титра антител, т.е. их инфекционная природа, устанавливается при исследовании парных сывороток. Так называют сыворотки, взятые от одного больного в разные сроки болезни с интервалом 5-7 дней.
При исследовании сыворотки любого человека в ней можно обнаружить антитела различного происхождения - инфекционные, постинфекционные, нормальные, поствакцинальные. Концентрации трех последних различны, но на протяжении достаточно длительных промежутков времени титр их находится на одном и том же уровне или постепенно снижается.
При инфекционных заболеваниях в связи с размножением возбудителей нарастает антигенное раздражение. В ответ на это в сыворотке возрастает количество инфекционных, связанных с заболеванием, антител.
Таким образом, титр инфекционных антител нарастает в динамике заболевания, при этом абсолютно не важно, в каком количестве обнаруживаются специфические антитела при первом исследовании.
Серологический метод диагностики применяют с конца первой, начала второй недели заболевания.
Для осуществления серологических реакций, т.е. взаимодействия антител с антигеном, при серодиагностике для обнаружения искомого антитела к сыворотке прибавляют известный антиген - или микроорганизмы, вызвавшие их образование, или их компоненты, обладающие иммуногенностью. В качестве известного антигена для серодиагностики используются разнообразные антигенные диагностикумы. Они могут быть обычными диагностикумами, представляющими собой взвесь убитых микроорганизмов или их отдельных антигенов, или эритроцитарными диагностикумами - взвесью эритроцитов, на которых адсорбированы микроорганизмы или их антигены.
57. Иммуноиндикация. Реакции иммунитета, применяемые при иммуноиндикации
Иммуноиндикация ? метод диагностики, имеющий целью обнаружение в исследуемом материале (от больного или в объектах внешней среды) микробных (или иных) антигенов.
Метод реализуется постановкой реакций иммунитета второго (РПГА, иммунофлюоресценции), третьего (ИФА, РИА) поколений.
Этот тип реакций можно представить в виде следующего равенства - хАГ + АТ=результат.
Стандартным диагностическим препаратом, т.е. известным компонентом реакций, содержащим антитела, при реализации этого метода являются иммунные (полученные на специализированных производствах путем иммунизации животных соответствующим антигеном) сыворотки (агглютинирующие, преципитирующие и т.п.).
Известные антитела для этой группы реакций могут быть адсорбированы на тех или иных носителях (эритроциты, частицы латекса, клетки стафилококков). В этом случае такие стандартные диагностические препараты называются, соответственно, эритроцитарными (латексными, коагглютинирующими ? КоА) антительными диагностикумами.
Для целей иммуноиндикации широко применяются реакции иммунитета с мечеными компонентами. Это методы иммунолюминесцентного, радиоиммунного, иммуноферментного анализа и ряд других иммунологических методик.
Реакции иммунитета, в которых по известному результату и известному антителу определяют природу неизвестного антигена, составляют суть метода иммуноиндикации.
58. Иммуноидентификация бактерий и вирусов. Реакции иммунитета, применяемые для иммуноидентификации бактерий и вирусов
Иммуноидентификация - определение свойств антигена, выделенной в ходе бактериологического исследования, определения чистой культуры бактерий.
Реакция позволяет изучить особенности выделенной культуры микроорганизмов.
Обычно данная реакция - заключительный этап бак. исследования.
Особенности выделенной культуры микроорганизмов изучаются с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела (серологическая идентификация микроорганизмов.)
При идентификации (серотипирования) чистой культуры возбудителя часто ставят ориентировочную пластинчатую реакцию агглютинации. На стекла вносят капли диагностических агглютинирующих сывороток, в которые вносят изучаемую чистую культуру возбудителя. Результат учитывается через несколько минут.
Если сыворотки неадсорбированные - после ориентировочной ставят развернутую реакцию агглютинации.
Принадлежность микроорганизма к данному виду или типу устанавливают лишь в том случае, если он агглютинируется соответствующей диагностической сывороткой не менее чем до Ѕ или ѕ ее титра.
Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы: первая -- специфическое соединение антигена и антитела, вторая -- кеспецифическая, т. е. образование видимого агглютината. Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.
59. Интерфероны: виды, механизм действия
Интерфероны - это вещества белковой природы, обладающие общими защитными свойствами. Продуцируются они клетками организма в ответ на внедрение болезнетворных вирусов.
В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: б, в и г-интерфероны.
Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами (лейкоцитарный); (фарм - альфаферон, виферон, альтевир)
Бета-интерферон синтезируется фибробластами (фибробластный) (фарм - авонекс, бетаферон, инвибета)
Гамма-интерферон -- он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами (иммунный) (фарм - ингарон)
Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, а также при воздействии индукторов интерферона, например: РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили название интерфероногенов
Механизм действия.
Интерферон связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.
Используют с профилактической целью при многих вирусных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепатиты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и заболеваний, связанных с иммунодефицитами.
Получение интерферона
а) путем инфицирования лейкоцитов или лимфоцитов крови человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конструируют из него препараты интерферона;
б) генно-инженерным способом -- путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона.
Интерферон, полученный генно-инженерным способом, носит название рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил официальное название «Реаферон».
60. Методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, их характеристика
Основная задача микробиологической диагностики инфекционных заболеваний - установление их этиологической природы.
Эта задача решается:
- Выделением из исследуемого материала микроба-возбудителя
- Обнаружением в материале его АГ или нуклеотидных последовательностей
- Выявлением образующихся в ходе развития инфекционного заболевания иммунологических изменений или АТ, или сенсибилизированных Т-лимфоцитов.
Выделяют три группы методов обнаружения возбудителя в исследуемом материале:
1. Классическое Бактериологическое исследование.
Цель: выделение и идентификация возбудителя.
Алгоритм бактериологического исследования:
- Первичная микроскопия (необязательно)
- Первичный посев для выделения чистой культуры
- Накопление чистой культуры
- Изучения комплекса биологических свойств выделенной культуры и ее идентификация.
Недостатки:
- Это достаточно длительный процесс (минимум 3-4 дня)
- Не всегда удается выделить возбудителя ( характерно для вирусных инфекций)
В связи с этим в настоящее время все большее развитие получают методы диагностики без выделения чистой культуры - «nonculturemethods». Эти методы позволяют обнаружить возбудителя или какие-либо его компоненты непосредственно в клиническом материале.
Примеры:
- Иммуноиндикация ? метод диагностики, имеющий целью обнаружение в исследуемом материале (от больного или в объектах внешней среды) микробных (или иных) антигенов. Метод реализуется постановкой реакций иммунитета второго (РПГА, иммунофлюоресценции), третьего (ИФА, РИА) поколений.
Молекулярно - генетическими методами в исследуемом материале обнаруживают нуклеотидные последовательности ДНК возбудителя:
- Метод ДНК-гибридизации.
Основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК возбудителя достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для второй нити используют ДНК зонды - лабораторно приготовленные фрагменты ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомого возбудителя.
Зонд метят радиоактивным изотопом или ферментом. В последнем случае для регистрации включения ДНК - зонда в ДНК бактерий к пробе добавляют субстрат, соответствующий использованному ферменту.
Положительная реакция субстрат-фермент проявляется в изменении окраски субстрата и свидетельствует о соответствии ДНК-зонда ДНК возбудителя, находящегося в исследуемом материале.
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Представляет собой метод направленной амплификации ДНК, позволяющий найти в исследуемом материале небольшие участки генетической информации любого организма и многократно умножить их.
Для реализации ПЦР создают набор праймеров - фрагментов ДНК - маркеров данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК.