Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке - А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.
Иммуноферментные методы.
Весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.
Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8-1,0 нг/мл.
Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1-0,2 нг/мл.
Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида [139], но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.
Метод полимеразной цепной реакции.
Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР - самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.
ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.
Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25-35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.
Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.
В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР).
Метод ОТ-ПЦР - высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.
Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.
Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве - это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша - Негри).
Выделение вируса.
Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».
Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2-3 дневных) белых мышах.
4) Структурное определение случая заболевания.
Болезнь встречается во все времена года и на всех континентах, за исключением некоторых островных территорий, таких как Япония, Австралия, Новая Зеландия, Исландия, о-ва Калимантан, Мартиника, Кипр, Мальта и др. Бешенство не регистрируется в Скандинавских странах, а также в Испании и Португалии. Но все-таки наибольшая заболеваемость бешенством встречается в летне-осенние месяцы, что обусловлено более тесными контактами людей с дикими животными и бродячими собаками. Заболевание регистрируется преимущественно среди сельского населения, чаще у детей.
На территории Российской Федерации существуют природные очаги бешенства. Эти очаги бешенства, поддерживаемые лисицами и енотовидными собаками, впервые были выявлены на территории РФ в начале 40-х годов XX в. в Астраханской области. В последующие годы очаги лисьего бешенства появились в ряде районов страны, ранее свободных от этой инфекции, где ежегодно регистрируются сотни случаев заболевания диких и домашних животных, а также около 20-50 заболеваний людей бешенством, большинство из которых отказались от вакцинации, а другие не прошли весь курс лечения.
Активно проводимая в последние годы защитниками животных борьба с уничтожением бездомных животных (собак и кошек) привела к значительному увеличению их количества в городах и селах, участились случаи нападения бродячих собак на человека и, следовательно, увеличивается риск заражения людей бешенством.
) Патогенез.
Проникновение вируса в клетку после заражения происходит путем адсорбционного эндоцитоза. Репликативный цикл осуществляется в цитоплазме зараженной клетки. Вирус тропен к клеткам ЦНС, особенно активно его репликация идет в нейронах головного мозга, клетках волокон Пуркинье, слюнных железах.
Вирус проникает через поврежденную кожу в мышечную и соединительную ткань. В клетках исчерченных мышц, в области нейромышечных и нейросухожильных периферических нервов происходит первичная репликация и сохранение его. В этот период никакие защитные иммунологические реакции против вируса еще не срабатывают. Вирус в латентном состоянии может сохраняться длительное время (иногда месяцы), а затем, проникнув в периневральное пространство афферентных периферических нервов, по их аксонам начинает продвигаться в ЦНС со скоростью 3 мм/ч. Такая локализация вируса в периневральных пространствах на этапе его продвижения к ЦНС по предложению румынского ученого С. Николау получила название «септиневрит».
В отношении вероятных путей продвижения вируса единого мнения нет: признавая ведущий путь по аксоплазме периферического нерва, не исключают возможность гематогенного и лимфогенного проникновения его в ЦНС. В качестве доказательства приводится тот факт, что антитела против вируса бешенства появляются как в ликворе, так и в крови, причем в крови раньше, чем в ликворе (7-й и 14-й дни после появления первых симптомов болезни соответственно).
Достигнув ЦНС, вирусы активно внедряются в нервные клетки серого вещества головного мозга, клетки спинного мозга, подкорковых узлов и других отделов; дальнейшее распространение в ЦНС идет от клетки к клетке; в это время вирусы появляются и в ликворе.
В пораженных нервных клетках возникают дегенеративные изменения; в результате взаимодействия вируса с пораженной клеткой в ней появляются специфические для бешенства включения в виде мелких округлых образований, не содержащих вирусную РНК, но имеющих в своем составе некоторые антигены возбудителя (тельца Бабеша - Негри). Наиболее многочисленны они в пирамидальных клетках гиппокампа, клетках Пуркинье мозжечка, продолговатого мозга, стенках III желудочка. В мозге (головном и спинном) в зоне поражения выявляются также периневральная и периваскулярная клеточная мононуклеарная инфильтрация, разрастание клеток глии («узелки бешенства»), В ткани мозга постепенно развиваются нарушение кровообращения и отек. Имеются данные, свидетельствующие о том, что при буйном бешенстве поражается преимущественно средний и продолговатый мозг, при паралитическом - спинной.
Проникновение вируса в клетку после заражения происходит путем адсорбционного эндоцитоза. Репликативный цикл осуществляется в цитоплазме зараженной клетки. Вирус тропен к клеткам ЦНС, особенно активно его репликация идет в нейронах головного мозга, клетках волокон Пуркинье, слюнных железах.
Вирус проникает через поврежденную кожу в мышечную и соединительную ткань. В клетках исчерченных мышц, в области нейромышечных и нейросухожильных периферических нервов происходит первичная репликация и сохранение его. В этот период никакие защитные иммунологические реакции против вируса еще не срабатывают. Вирус в латентном состоянии может сохраняться длительное время (иногда месяцы), а затем, проникнув в периневральное пространство афферентных периферических нервов, по их аксонам начинает продвигаться в ЦНС со скоростью 3 мм/ч. Такая локализация вируса в периневральных пространствах на этапе его продвижения к ЦНС по предложению румынского ученого С. Николау получила название «септиневрит».
В отношении вероятных путей продвижения вируса единого мнения нет: признавая ведущий путь по аксоплазме периферического нерва, не исключают возможность гематогенного и лимфогенного проникновения его в ЦНС. В качестве доказательства приводится тот факт, что антитела против вируса бешенства появляются как в ликворе, так и в крови, причем в крови раньше, чем в ликворе (7-й и 14-й дни после появления первых симптомов болезни соответственно).
Достигнув ЦНС, вирусы активно внедряются в нервные клетки серого вещества головного мозга, клетки спинного мозга, подкорковых узлов и других отделов; дальнейшее распространение в ЦНС идет от клетки к клетке; в это время вирусы появляются и в ликворе.
В пораженных нервных клетках возникают дегенеративные изменения; в результате взаимодействия вируса с пораженной клеткой в ней появляются специфические для бешенства включения в виде мелких округлых образований, не содержащих вирусную РНК, но имеющих в своем составе некоторые антигены возбудителя (тельца Бабеша - Негри). Наиболее многочисленны они в пирамидальных клетках гиппокампа, клетках Пуркинье мозжечка, продолговатого мозга, стенках III желудочка. В мозге (головном и спинном) в зоне поражения выявляются также периневральная и периваскулярная клеточная мононуклеарная инфильтрация, разрастание клеток глии («узелки бешенства»), В ткани мозга постепенно развиваются нарушение кровообращения и отек. Имеются данные, свидетельствующие о том, что при буйном бешенстве поражается преимущественно средний и продолговатый мозг, при паралитическом - спинной.
Смерть больных наступает на фоне прогрессирующего специфического рабического энцефаломиелита вследствие асфиксии или тяжелых кардиоваскулярных расстройств.
Посмертные изменения обнаруживаются кроме ЦНС в периферических нервах и ганглиях, преимущественно в месте внедрения вируса (распад миелиновых оболочек, лимфоидные инфильтраты), в сердечной мышце (интестинальный миокардит на фоне клеточной инфильтрации), в слюнных, слезных железах, мозговом слое надпочечников, поджелудочной железе. Отек и полнокровие, а иногда и мелкие геморрагии выявляются в легких, на слизистой оболочке желудка. Эти изменения тем отчетливее выражены, чем длительнее протекает болезнь. Обычно она очень быстротечна - финал наступает на 5-7-й день, а часто и раньше.
Бешенство - заболевание, которое пока практически всегда у человека заканчивается смертью, существуют лишь несколько сообщений о случаях выздоровления, но и они подвергаются сомнению. У животных (в частности, у летучих мышей) возможно латентное течение инфекции, описаны единичные подобные случаи у собак. Возможность длительного инкубационного периода (несколько месяцев и даже лет) позволяет некоторым исследователям относить бешенство к медленным инфекциям.
Сообщается об отдельных случаях выявления антирабических антител у людей, которые никогда не прививались против бешенства, тем не менее возможность латентной инфекции у человека не доказана.
Вопрос о роли защитных антител заслуживает особого внимания. В обычных условиях смерть больного наступает раньше, чем в крови и тем более в ликворе появятся защитные антитела (главным образом вируснейтрализующие). Таким образом, свою функцию они выполнить не успевают. Вирус бешенства стимулирует также интерферонобразование, но и это не предотвращает смерть.
Бешенство все еще является terra incognita для исследователя и клинициста. Невозможность изучить его экспериментально на человеке, кратковременность течения не позволяют объяснить многие патогенетические особенности течения этой болезни. Механически же переносить на человека сведения, полученные в опытах на животных, нельзя, поскольку отличия весьма существенны: животные различаются по степени чувствительности к вирусу, у разных видов отличны и сроки появления вируса в слюне, у многих видов возможно латентное течение инфекции, длительное носительство и выделе
ние вируса и т.д. Отличаются и проявления энцефалита: если больное животное становится агрессивным, перестает бояться человека, стремится напасть на окружающих, то больной бешенством человек даже во время приступа гидрофобии на фоне галлюцинаторного синдрома сохраняет, видимо, какой-то контроль, не позволяющий проявиться агрессии по отношению к другим людям.
Клиническое течение болезни.
Бешенство - прогрессирующая нейровирусная болезнь, в развитии которой выделяют следующие периоды: инкубационный, начальный, или продромальный (депрессии), разгара (возбуждения) и терминальный (паралитический).
Инкубационный период продолжается от 10 до 90 дней, в редких случаях до 1 года и более. Значительная вариабельность инкубационного периода связана с различными факторами: локализацией укуса (наиболее короткий - при укусах в голову, кисти рук; наиболее длинный - при укусах в стопы), возрастом укушенного (у детей короче, чем у взрослых), видом укусившего животного, реактивностью макроорганизма, размером и глубиной раны, дозой возбудителя, попавшего в рану.
В продромальный период (продолжительностью 1-3 дня) первые признаки болезни обнаруживаются в месте укуса: рубец вновь припухает, краснеет, появляются зуд, невралгические боли по ходу нервных путей, ближайших к месту укуса. Возникают общее недомогание, головная боль, могут отмечаться диспептические явления и сухость во рту, снижается аппетит, язык обложен. Появляются повышенная чувствительность к зрительным и слуховым раздражителям, гиперестезия, иногда чувство стеснения в груди и глотке. Температура становится субфебрильной. Больной подавлен, плохо спит, сон у него сопровождается кошмарными сновидениями, затем устанавливается бессонница. Больные испытывают беспричинный страх, тревогу, чувство тоски; появляются мысли о смерти. Продромальные явления усиливаются. Присоединяются тошнота, нередко рвота, потливость, мидриаз, но реакция зрачка на свет при этом сохранена.