Автореферат: Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов

Таким образом, получена серия флуоресцентных полимерных носителей на основе гомо- и сополимеров акролеина, а, также на основе наночастиц из этилцеллюлозы, содержащих полупроводниковые НК. Широкий диапазон диаметров частиц (100-500 нм), высокая интенсивность флуоресценции полученных флуоресцентных полимерных дисперсий, фотостабильность, возможность в широких пределах варьировать цвет флуоресценции, используя при этом монохроматический источник возбуждения, открывают широкие возможности их использования в различных видах биоанализа.

Перечень разработанных типов флуоресцентных полимерных носителей и их характеристики приведены в сводной таблице 4.

Таблица 4. Характеристики флуоресцентных полимерных дисперсий

4. Примеры использования флуоресцентных полимерных частиц в биоанализе

4.1 Использование флуоресцентных полимерных микросфер в РЛА

Полученные флуоресцентные полимерные микросферы, содержащие альдегидные группы, которые могут вступать в реакции с белками, представляют большой интерес для использования в качестве флуоресцентных носителей в различных видах биоаналитических тестов, основанных на специфическом высокоаффинном взаимодействии между детектируемым лигандом и реагентом, содержащим антилиганд, к которому могут быть отнесены реакции «антиген-антитело», «биотин-стрептавидин», «углевод-лектин», «иммуноглобулин-белок А», «транспортный белок-рецепторный белок», «холестерин-дигитонин», «комплементарные олиго- и полинуклеотид» и др. Существуют различные методы проведения анализов с участием полимерных микрочастиц, такие как РЛА в планшете, на стекле, на фильтре, в объеме, стрип-тесты, микрочипы и т.д.

Нами была разработана единообразная методика получения конъюгатов полимерных флуоресцентных микросфер разного размера с антителами и пептидными лигандами и получена серия конъюгатов с моноклональными антителами к антигену Y.pestis, антителами IgG человека к ревматоидному фактору, антителами IgG человека к L.monocytogenes 1-й и 2-й серогрупп и т.д. Иммунохимическую активность полученных реагентов определяли с помощью РЛА в планшете как наиболее простом и хорошо отработанном методе регистрации результата взаимодействия антител и антигена.

В качестве примера приведены результаты РЛА с использованием конъюгатов флуоресцентных микросфер ПА¹-ПС¹ (2.1, табл. 4) с моноклональными антителами к антигену Y.pestis (рис. 15). Найдено, что при использовании ПА¹:ПС¹, наполненных НК, и концентрации добавленных антител 4.8 мг/мл, минимально детектируемая концентрация составляет 15 нг/мл, что несколько ниже чувствительности иммуноферментного анализа, в целом, более трудоемким по сравнению с процедурой проведения РЛА. Время проведения РЛА составляет не более 2 ч.

Рис. 15. Результаты РЛА флуоресцентных сополимерных микросфер ПА¹:ПС¹ с включенными НК (диаметр ядра CdSe 3,7 нм). Микросферы сенсибилизированы моноклональными антителами к Y.pestis (0,8 мг/г полимера). 1-й ряд - реакция агглютинация при добавлении антигена Y.pestis (начальная концентрация антигена 1 мг/мл). 2-й ряд - отрицательный контроль - при добавлении нормальной кроличьей сыворотки.

Флуоресцентные наночастицы на основе этилцеллюлозы с диаметром частиц 200 нм (2.6, табл. 4) тестировали в РЛА на стекле. Анализ, основанный на реакции пассивной агглютинации на стекле, позволяет быстро, в течение нескольких минут, дать ответ о присутствии детектируемого антилиганда. На поверхность флуоресцентных этилцеллюлозных частиц иммобилизовали моноклональные антитела к антигену Y.pestis. Антитела добавляли в количестве от 3 до 10 мг/г полимера. Результаты реакции РЛА в УФ-свете показали, что чувствительность анализа составляет 5 мкг/мл, а время проведения анализа не превышает 5 мин.

4.2 Иммунофлуоресцентное мечение клеток полимерными микросферами, наполненными НК

Для анализов, связанных с визуализацией специфических рецепторов на поверхности клеток, необходимо использовать флуоресцентные полимерные носители-маркеры, диаметр которых не превосходит 250 нм. Этому критерию соответствуют флуоресцентные полимерные микросферы ПА¹⁰:ПС¹ (2.5, табл. 4) с включенными НК с л_эм=610 нм. Указанные микросферы конъюгировали с мини-анителами 4D5scFv-His₅, взятыми в различных концентрациях, для визуализации онкомаркера HER2/neu, гиперэкспрессирующегося на поверхности многих раковых клеток (при раке молочной железы, предстательной железы, яичника, желудка, легких). Ранняя диагностика HER2/neu, гиперэкспрессия которого ассоциирована со злокачественными опухолями и неблагоприятным прогнозом у пациентов, является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. После обработки полученными конъюгатами клеток SKBR-3, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2/neu, наблюдалось характерное свечение клеток, причем интенсивность флуоресценции коррелировала с концентрацией антител в образцах (рис.16).

После инкубации клеток с полимерными частицами, конъюгированными с овальбумином в тех же концентрациях, флуоресцентного свечения клеток не наблюдалось (рис.16). Таким образом, связывание полимерных частиц, конъюгированных с мини-анителами 4D5scFv-His₅ с HER2/neu-гиперэкспрессирующими клетками является специфическим, и полученные конъюгаты могут быть использованы для мечения и визуализации опухолевых клеток.

Рис. 16. Микрофотографии клеток SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами ПА¹⁰-ПС¹, конъюгированными с 4D5-His₅.

Концентрация 4D5scFv-His₅ в конъюгирующей смеси 0.425 мкг/мл 5% дисперсии (1) и 0.085 мкг/мл (2), (3) - контроль, клетки SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами ПА¹⁰-ПС¹, конъюгированными с овальбумином.

4.3 Иммунофлуоресцентное мечение клеток НК, модифицированных тиолсодержащими молекулами

НК, модифицированные тиолсодержащими молекулами, были испытаны как флуоресцентные маркеры для визуализации комплекса “лиганд-антилиганд”. Малый размер таких частиц (5-10 нм) даст возможность применять их в анализах in vitro и in vivo для мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

НК, модифицированные цистеином (Цис-НК) были использованы для специфического мечения клеток и идентификации онкомаркера HER2/neu в лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН (член-корр.РАН Деев С.М.). Цис-НК конъюгировали с белком барстаром методом карбодиимидной активации карбоксильных групп. Тест был выполнен на клетках человеческой аденокарциномы яичника линии SKOV-3 (рис. 17). После предварительной обработки клеток 4D5scFv-барназа-His₅ полученные конъюгаты гидрофилизированных цистеином НК с барстаром с высокой специфичностью окрашивали поверхность HER2/neu -гиперэкспрессирующих клеток линии SKOV-3.

Рис. 17. Микрофотографии клеток SKOV-3, окрашенных конъюгатом барстар - Цис-НК. а - SKOV-3, меченные конъюгатом барстар -Цис-НК после обработки клеток 4D5scFv-барназа-His₅. б - Контроль - SKOV-3, меченные конъюгатом барстар-Цис-НК.

Полученные результаты свидетельствуют о специфичности взаимодействия полученных конъюгатов, а также демонстрируют потенциальную возможность использования таких НК для визуализации опухолевых клеток, экспрессирующих онкомаркер HER2/neu.

4.4 Визуализация объектов внутри биологических тканей методом флуоресцентной оптической диффузионной томографии

Уникальные оптические свойства полупроводниковых НК, такие как фотостабильность и широкий диапазон полос флуоресценции в зависимости от диаметра ядра НК, в том числе и в ближнем инфракрасном диапазоне, делают их привлекательными для использования в качестве in vivo маркеров при визуализации глубоко расположенных тканей и органов. С целью определения принципиальной возможности детекции НК методом ФДТ гидрофилизированные цистеином НК с максимумом флуоресценции 620 нм в диапазоне концентраций 0.003-0.3 мг/мл запаивали в стеклянную капсулу и помещали в пищевод животных (имитация детекции опухоли, контрастированной мечеными НК лигандами, имеющими высокую афинность к рецепторам на поверхности опухолевых клеток). Исследуемый объект сканировали в конфигурации «на просвет» лазерным источником излучения во флуоресцентном оптическом диффузионном томографе (ФДТ-установке), разработанном в лаборатории биофотоники ИПФ РАН под руководством к.ф.-м.н. В.А. Каменского. В результате методом флуоресцентной оптической диффузионной томографии были получены изображения капсул с высоким контрастом, что хорошо видно на рис. 18.

Рис. 18. Стеклянная капсула с Цис- НК (концентрация - 0.003 мг/мл). Внутренний диаметр капсулы 2 мм. Флуоресцентный диффузионный томограф, экспериментальный прибор (ИПФ РАН). Характеристики прибора: лазерный источник излучения Nd:YAG с удвоением частоты, = 532 нм, детектор: Hamamatsu H7422-20.

Данный результат показывает, что полученные в работе гидрофилизированные НК могут быть использованы в качестве визуализирующих контрастирующих агентов - маркеров в методе оптической томографии in vivo на глубине 0,5- 1,5 см.

4.5 Цитофлуориметрический анализ

Другой вариант использования флуоресцентных полимерных дисперсий - проточная цитофлуориметрия, позволяющая анализировать спектральные свойства каждой из проходящих через детектор микросферы. Использование спектрально кодированных полимерных микросфер предполагает анализ каждой микросферы для выявления присутствия в анализируемой пробе каждого из детектируемых объектов.

Полимерные дисперсии ПА¹-ПС¹ и содержащие НК двух типов с максимумами флуоресценции 530 и 610 нм, использовали для мечения и регистрации клеток линии Jurkat (Т-лимфобластной лейкемии) методом проточной цитофлуориметрии. В результате инкубации в течение 20 минут на поверхности клеток Jurkat сорбировалось в среднем 10-15 флуоресцентных полимерных микросфер (рис. 19).

Фон рассеяния немеченых клеток отсекается выбором минимального уровня регистрации по каналу FL3 (605-635 нм) - 1·10² (показан горизонтальной линией). Регистрация сигнала выше этого уровня позволяет выявить клетки, меченные «красными» полимерными микросферами (л_эмисс=610 нм). Клетки с адсорбированными на поверхности полимерных микросфер двух цветов л_эмисс=610 нм и 530 нм дают примерно одинаковый вклад в оба канала регистрации: FL1 (505-545 нм) и FL3 (605-635 нм). Сигналы от этих клеток выделяются выбором минимальных уровней регистрации по каналам FL1 и FL3 - 5·10² и 1·10² соответственно (показаны вертикальной и горизонтальной линиями).

Таким образом, продемонстрирована возможность использования полимерных дисперсий, содержащих флуоресцентные НК, в цитофлуориметрии.

Рис. 19. Мечение клеток Jurkat флуоресцентными полимерными микросферами ПА¹-ПС¹: (а) - исходные клетки, (б) - клетки, меченные микросферами, кодированными «красными» НК (л_эмисс = 610 нм) и (в) - клетки, меченные микросферами, кодированными смесью «красных» и «зеленых» НК (л_эмисс = 610 нм и 530 нм). Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (каналы регистрации - FL1 - 505-545 нм; FL3 - 605-635 нм; возбуждение - аргоновый лазер, л_возб. = 488 нм).

5. Получение пленок гидрофильных НК с двумя различными длинами волн флуоресценции на поверхности оптических стекол

Продолжением работ по формированию пленок НК стало формирование пленок гидрофилизированных НК на поверхности оптических стекол. Была разработана методика получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными длинами волн флуоресценции на поверхности покровных стекол, модифицированных поли-L-лизином. Полученные пленки характеризовались плотной упаковкой и высокой пространственной однородностью, что, в конечном счете, определяет стабильность флуоресцентных свойств на макромасштабном уровне при многократном сканировании одного и того же участка.

Полученные в результате пленки флуоресцентных гидрофилизированных НК обладают высоковоспроизводимыми свойствами: отношение сигнального пика флуоресценции к референсному составляет 1.5±0.1 и не изменяется на макромасштабных расстояниях более чем на 0.2% (рис. 20). Кроме того, такие пленки обладают очень высокой трибологической устойчивостью и не требуют дополнительных защитных покрытий (рис. 21).

Рис. 20. Спектрально - морфологическое исследование тестовых участков покровного стекла с нанесенными пленками из «зеленых» и «красных» гидрофилизированных цистеином НК.

Рис. 21 Демонстрация трибологической устойчивости осажденных на покровное стекло пленок гидрофилизированных НК. Последовательное сканирование одного и того же участка 10 раз подряд, показаны результаты первого и десятого сканирования.

Планируется, что разработанная методика по формированию пленок НК с двумя с двумя различными длинами волн флуоресценции будет в дальнейшем развита для нанесения пленок НК на излучающую апертуру оптоволоконных зондов для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии для создания FRET-зондов. - наличие двух достаточно далеко разнесенных полос флуоресценции от НК двух типов позволит проводить не прямое измерение интенсивности флуоресценции, модулируемой взаимодействием донорных НК с исследуемым объектом, а измерение относительных интенсивностей двух пиков флуоресценции - от донорных (взаимодействующих по механизму FRET с исследуемым веществом) и от референсных (не взаимодействующих) НК, что значительно повысит достоверность получаемых результатов.

Выводы

1. Исследованы свойства и поведение полупроводниковых CdSe/ZnS НК структуры ядро/оболочка в конденсированных средах. Показано, что при предельно высокой плотности НК сохраняется эффект размерного квантования. Показано, что при средних расстояниях между нанокристаллами ниже двух их диаметров, происходит ухудшение их оптических свойств (снижение квантового выхода, смещение положения пика флуоресценции в красную область).