Автореферат: Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов

Для выбора оптимальной структуры дисперсии на основе акролеина синтезировали разными способами. Полимерные микросферы на основе гомополимеров акролеина получали методами как анионной полимеризации в водно-щелочной среде (ПА^А, соотношение фаз 1:20, рН 11, Т_комн.), так и радикальной полимеризации (ПА^Р_, соотношение фаз 1:9, водорастворимый инициатор персульфат калия K₂S₂O₈, Т=65°С). Как видно из данных, представленных в таблице 2, полимерные микросферы обоих типов характеризовались высокой коллоидно-химической стабильностью и низкой растворимостью в органических растворителях (не более 2%), при этом полимерные микросферы с минимальным диаметром и максимальным содержанием альдегидных групп получены методом радикальной полимеризации.

Таблица 2. Характеристики полимерных дисперсий на основе акролеина

Введение гидрофобных НК в полимерные микросферы на стадии синтеза приводило к тушению флуоресценции. Поэтому была разработана методика введения НК в уже синтезированные полимерные дисперсии, которая заключается в предварительном набухании полимерных частиц в органическом растворителе (этанол, изопропиловый спирт), добавлении НК в смеси того же растворителя с хлороформом, удалении растворителя и переводе полученных полимерных микросфер с включенными НК в водную среду.

Рис. 8 Сравнение интенсивности флуоресценции (норм.) полимерных дисперсий ПА^А (1) и ПА^Р(2).

Флуоресцентные полимерные дисперсии ПА^А и ПА^Р характеризовались высокой степенью включения НК; при примерно одинаковой интенсивности флуоресценции (рис. 8).

Оценку флуоресцентных свойств дисперсий ПА^А и ПА^Р проводили методом флуоресцентной лазерной микроскопии. Для этого дисперсии наносили на кремниевые подложки и высушивали. Флуоресценцию микросфер возбуждали аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 488 нм и мощностью не более 0.01 мВт. Найдено, что включение НК в полиакролеиновые микросферы приводит к смещению пика эмиссии НК в синюю область в зависимости от состава микросфер и параметров НК (в случае НК с л_эм.=546 нм - смещение в синюю область на 12 нм, НК с л_эм.=583 нм - на 18 нм соответственно). Наиболее вероятной причиной синего сдвига пика эмиссии НК при включении в микросферы является устранение излучающих поверхностных состояний НК с энергией меньше энергии фундаментального перехода, вызванное формированием вокруг НК полимерной оболочки, обусловливающим, кроме того, подавление каналов тушения флуоресценции НК. Последнее, является причиной возрастания интенсивности флуоресценции по сравнению с флуоресценцией исходных НК.

Как и в случае с пленками НК, использованная в настоящей работе аппаратура (конфокальный флуоресцентный микроскоп и аргоновый лазер) позволяла работать при мощности возбуждения 10³ Вт/см². При такой плотности мощности обычные органические флуорофоры полностью теряют свои флуоресцентные свойства через несколько минут после начала облучения. Как было показано ранее, в отличие от органических флуорофоров, нанокристаллы флуоресцируют и при плотности мощности облучения до 10⁶ Вт/см². В диапазоне 10⁶-10⁷ Вт/см² квантовый выход несколько снижается, но НК продолжают флуоресцировать.

В случае дисперсий ПА^А, данные флуоресцентной лазерной микроскопии показывают присутствие не связанных с полимерными микросферами НК, что проявляется в виде флуоресцентного фона от участков подложки, свободных от микросфер. По видимому, присутствие единичных НК, обусловлено образованием значительного количества олигомеров акролеина, которые могут связываться с НК в объеме и, таким образом, приводить к снижению степени включения НК в микросферы и появлению общего флуоресцентного фона, что существенно ограничивает использование таких полимерных дисперсий в качестве носителей биомолекул. Дисперсии ПА^Р характеризовались высокой степенью включения НК в микросферы, однако агрегативная устойчивость дисперсий оказалась недостаточно высокой.

Полученные результаты показали необходимость повышения агрегативной устойчивости полимерных дисперсий и снижения образования олигомерных продуктов в процессе хранения дисперсий. С этой целью была проведена сополимеризация акролеина со стиролом. Во-первых, путем встраивания мономерных звеньев стирола возможно снизить количество образующихся полуацеталей, характерных для гомополимеризации акролеина, и таким образом повысить коллоидную и химическую устойчивость полимерных дисперсий, во-вторых, варьируя соотношения мономеров - акролеина и стирола, можно получить частицы в широком диапазоне диаметров для различных биологических приложений.

3.2 Включение НК в сополимерную матрицу на основе акролеина и стирола

Сополимерные дисперсии на основе акролеина и стирола с сотношением мономеров 1:1 (ПА¹:ПС¹), 5:1 (ПА⁵:ПС¹), 10:1 (ПА¹⁰:ПС¹) были синтезированы методом радикальной сополимеризации (соотношение фаз 1:9, инициатор K₂S₂O₈, Т=65°С) (рис. 9).

Наибольшая начальная скорость роста и минимальный диаметр частиц дисперсий были отмечены в случае максимального (10:1) содержания акролеина в исходной мономерной смеси.

Характеристики полученных сополимерных дисперсий приведены в таблице 3. Как видно, все полимерные дисперсии характеризуются высокой коллоидной стабильностью, содержат поверхностные альдегидные группы, а диапазон диаметров полученных микросфер (145 - 420 нм) позволит их использовать в качестве маркеров в различных биоаналитических тестах, например, РЛА в планшете и на стекле, цитофлуориметрии, а также для окрашивания и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

Рис. 9. Микрофотографии полимерных микросфер, полученных сополимеризацией акролеина и стирола при соотношении мономеров акролеин:стирол 1:1 (а) и 10:1 (б).

Таблица 3. Характеристики сополимерных дисперсий на основе акролеина и стирола с различным соотношением мономеров

Оценку флуоресцентных свойств проводили методом флуоресцентной лазерной микроскопии. Во всех трех случаях флуоресцентный фон от участков подложки, свободных от микросфер, отсутствовал полностью, что свидетельствует об отсутствии не связанных с микросферами НК и практически полном их включении в полимерную матрицу. Сополимерные дисперсии ПА⁵:ПС¹ характеризовались относительно невысокой интенсивностью флуоресценции, и в дальнейшем исследование их свойств не проводилось (рис. 10).

Рис. 10. Сравнение интенсивности флуоресценции (норм.) сополимерных ПА-ПС дисперсий с включенными НК (583 нм): ПА¹:ПС¹ (1), ПА⁵:ПС¹ (2), ПА¹⁰:ПС¹ (3).

Так же как и в случае микросфер на основе гомополимеров акролеина, для сополимерных микросфер было отмечено смещение пика эмиссии в синюю область спектра, при этом для микросфер ПА¹:ПС¹ со включенными НК с л_эм.=583 нм смещение составило 16 нм, а в случае микросфер ПА¹:ПС¹⁰ - 8 нм.

Сравнение флуоресцентных свойств единичной микросферы и агрегатов микросфер показало, что положение максимума и полуширина спектра флуоресценции практически одинаковы (рис. 11). Это свидетельствует о том, что НК внедряются в микросферы достаточно глубоко и переноса энергии между НК, находящимися в соседних микросферах, не происходит.

Рис. 11. Спектры флуоресценции единичных микросфер и агрегатов сополимерных микросфер, содержащих НК: ПА¹-ПС¹(а), ПА¹⁰-ПС¹(б).

3.3 Введение в полимерные дисперсии на основе акролеина смеси НК с различными длинами волн флуоресценции

Введение в полимерные микросферы смесей НК с разными длинами волн флуоресценции в разных соотношениях позволяет реализовать спектрально кодированные микрочастицы, получение которых открывает пути для разработки тест-систем для экспрессного многопараметрического анализа большого числа биологических объектов, основанного на технике микрочипов. Одним из преимуществ использования в качестве флуорофоров НК с разными длинами волн эмиссии является возможность возбуждения всех кодирующих компонентов одним монохроматическим источником.

В качестве модельного полимерного носителя для включения смеси НК с разными длинами волн флуоресценции мы использовали сополимерные микросферы на основе акролеина и стирола с диаметром частиц 420 нм. Для кодирования полимерных дисперсий использовали НК с максимумами флуоресценции 546 и 583 нм в различных соотношениях. Как видно из рис. 12, интенсивность флуоресценции сополимерных частиц с включенными НК не пропорциональна добавляемой концентрации НК. Вероятно, инклюзия зависит от диаметра НК: чем меньше диаметр НК, тем легче и глубже НК проникают внутрь полимерной частицы.

Рис. 12. Флуоресценция полимерных микросфер, кодированных НК двух цветов: НК с л_эм. = 583 нм (1); смесь НК с л_эм. = 583 и 546 нм в соотношении: 1:1 - (2), 10:1 - (3), 100: 1 - (4); НК с л_эм. =546 нм (5).

Полученные оптически кодированные полимерные микросферы сохраняли коллоидную и химическую устойчивость в течение, по крайней мере, 6 месяцев. Изучение флуоресцентных свойств показало, что спектры флуоресценции отдельных полимерных микросфер и агрегатов микросфер не отличаются между собой, что свидетельствует о практически полном отсутствии взаимодействия между НК, находящихся в разных полимерных микросферах (рис. 13).

Рис. 13 (а) Спектры флуоресценции отдельной полимерной микросферы (красная кривая) и агрегатов микросфер (зеленая и черная), содержащих НК двух цветов. (б) Разложение пика флуоресценции на полосы флуоресценции включенных в полимерные микросферы двух цветов НК.

Отсутствие взаимодействия между НК как внутри одной, так и между соседними полимерными микросферами является необходимым условием для разработки метода введения заданного количества НК разных цветов в полимерные дисперсии, т.е. оптического кодирования полимерных микросфер.

3.4 Включение НК в частицы на основе природных полимеров

Разработанная методика включения НК в полимерные микросферы на основе акролеина позволила использовать в качестве матриц и частицы на основе природного происхождения. В качестве флуоресцентного носителя для использования в тест-системах, разработке диагностикумов, а также для визуализации клеток и клеточных структур могут выступать и наночастицы на основе природных полимеров, в частности производные целлюлозы. В настоящей работе использовали наночастицы из этилцеллюлозы, полученные методом обращения фаз при постоянной температуре, любезно предоставленные проф. А.Л. Камышным (Hebrew University, Israel).

Включение гидрофобных НК в этилцеллюлозные (ЭЦ) наночастицы осуществляли аналогично включению НК в полимерные микросферы на основе акролеина, при этом прирост диаметра частиц после включения НК был незначительным. Изучение флуоресцентных свойств показало наличие сдвига максимума флуоресценции на 6 нм в синюю область. Квантовый выход НК, включенных в ЭЦ наночастицы, увеличивается более чем в 1,5 раза по сравнению с исходными НК (рис. 14 а).

Кроме этого, была разработана методика включения в этилцеллюлозные частицы НК, предварительно гидрофилизированных смесью меркаптоуксусная кислота/меркаптоэтанол (МУК-НК). Такой способ также позволяет получить флуоресцентные наночастицы на основе этилцеллюлозы, однако в данном случае прирост квантового выхода незначителен (рис. 14 б). Вероятно, гидрофильная природа НК препятствует непосредственному контакту полимера с поверхностью нанокристалла, что, соответственно, не приводит к подавлению дефектов поверхности НК.

Рис. 14 (а). Сравнение интенсивностей флуоресценции исходных НК и НК, включенных в ЭЦ частицы (3.5 нм, л_эм. = 546 нм). На врезке изображения исходных НК в водно-метанольной (1:1) смеси и ЭЦ частиц с включенными НК. (б) Сравнение интенсивностей флуоресценции МУК-НК, включенных в ЭЦ частицы (1) и исходных МУК-НК (2).

Стоит отметить, что оба подхода позволяют получить флуоресцентные частицы на основе этилцеллюлозы, при этом способ введения гидрофобных НК в ЭЦ частицы приводит к большему приросту квантового выхода по сравнению с методом включения гидрофилизированных НК в ЭЦ частицы.

Введение НК в полимерную матрицу как из этилцеллюлозы, так и из полимеров на основе акролеина привело к увеличению квантового выхода и, следовательно, к подавлению каналов тушения флуоресценции НК. Кроме того, подавлением каналов тушения можно частично или полностью устранить флуктуации флуоресценции одиночных НК, которые весьма нежелательны при разработке многоцветных флуоресцентных реагентов для высокочувствительной визуализации в биоанализе, и таким образом стабилизировать сигнал флуоресценции.