Автореферат: Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов

Далее было исследовано влияние плотности мощности возбуждающего излучения на интенсивность флуоресценции пленок с предельно высокой концентрацией НК методом лазерной индуцированной люминесценции. На Рис. 3 представлена зависимость интенсивности флуоресценции от плотности возбуждающего излучения. Как видно, положение максимумов и полуширины спектров флуоресценции пленок не меняются при увеличении плотности потока лазерного излучения до 110⁶ Вт/см². При высокой плотности возбуждения квантовый выход сильно падает, однако флуоресценция сохраняется. Важно отметить, что мощности возбуждения порядка 110³ предельны для органических красителей. Таким образом, полностью возможности флуоресцентных проб на основе полупроводниковых НК могут быть реализованы при использовании высоких плотностей мощности. В этом случае можно ожидать повышения чувствительности аналитических устройств, по крайней мере, на 3 порядка.

Рис. 2 Сравнение флуоресценции НК (CdSe/ZnS диаметром 4 нм) и флуоресценции ацетата родамина 6Ж: (а) - растворы НК и Р6Ж, (б) - пленки. Возбуждение - 532 нм, плотность мощности возбуждения - 4*10³ Вт/см².

Рис. 3 Спектры флуоресценции пленки с высокой концентрацией НК диаметром 4 нм. Толщина пленки 100 нм. Возбуждение флуоресценции лазерным излучением с л = 523 нм с различными плотностями потока.

Полученные результаты дают оценку оптимальной плотности НК в конденсированном состоянии: средние расстояния не должны быть меньше 2 диаметров НК, иначе они влияют друг на друга, что приводит к ухудшению оптических свойств НК (красное смещение, существенное снижение квантового выхода). Поэтому, для последующего включения в полимерную матрицу мы подбирали концентрации НК таким образом, чтобы красного смещения не происходило.

2. Получение водных дисперсий НК путем модификации НК природными и синтетическими полимерами

Для того, чтобы флуоресцентные наноразмерные частицы могли быть использованы в качестве флуоресцентных биомареров в in vitro и in vivo анализах для визуализации клеток, кодирования ДНК, направленной доставки наночастиц в клетки и т.д., они должны характеризоваться высокой коллоидной устойчивостью, малыми размерами частиц - до 100 нм, а также наличием функциональных групп на поверхности для визуализации образования комплекса «лиганд - антилиганд». Решение указанных задач и рассматривается данном разделе работы.

2.1 Модификация НК посредством замещения ТОФО бифункциональными лигандами с последующим формированием защитного слоя

Данный способ модификации основан на образовании дисульфидной связи между атомами, входящими в состав оболочки ZnS и меркаптогруппой тиолсодержащих соединений путем замещения стабилизирующего лиганда ТОФО на поверхности НК и последующим формированием дополнительного защитного полимерного слоя.

Рис. 4 (а) Интенсивность флуоресценции НК (диаметр 4 нм), НК, модифицированных цистеином (Цис-НК) и смесью меркаптоуксусная кислота/меркаптоэтанол (МУК-НК). (б) Распределение частиц по размерам для НК, модифицированных цистеином.

Изначально нами были реализованы и усовершенствованы известные методики по модификации НК с помощью цистеина и меркаптоуксусной кислоты. Исходные гидрофобные НК модифицировали тиолсодержащими молекулами, в частности цистеином и смесью меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота (мольное соотношение 1/1). Полученные гидрофилизированные НК характеризовались средними размерами частиц 5 и 8 нм соответственно, то есть практически сохранялись размеры исходных частиц, что свидетельствует о модификации индивидуальных НК, а также высокой интенсивностью флуоресценции (рис. 4 а), однако в водном растворе сохраняли коллоидную устойчивость не более 1 месяца. Причиной снижения коллоидной устойчивости является, вероятно, динамический характер связи (Zn-S, S-S) бифункционального лиганда с поверхностью НК. Можно предположить, что солюбилизирующий лиганд постепенно переходит в водную среду, приводя к агрегации модифицированных НК. При этом ионы кадмия, входящие в состав ядра НК, также могут переходить в раствор и контактировать с окружением НК, что ограничивает их биосовместимость. Следует отметить, что модификация НК тиолсодержащими молекулами приводит к уменьшению квантового выхода более чем на 10% и красное смещение максимума флуоресценции составляет 5 - 10 нм (рис. 4 а).

С целью увеличения коллоидной устойчивости и повышения биосовместимости была разработана методика формирования дополнительного защитного слоя посредством образования ковалентных связей или электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными карбоксильными группами гидрофилизированных НК и аминогруппами биомолекул или катионных ПАВ. В настоящей работе использовали полипептид поли-L-лизин, полисахариды (хитозан), а также синтетический поликатион полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ). Образование дополнительного полимерного слоя контролировали методом ИК-спектроскопии. Такая способ дополнительной модификации гидрофилизированных НК привел к увеличению коллоидной устойчивости (частицы сохраняли стабильность в течение как минимум 2 месяцев) и интенсивности флуоресценции (Рис. 5, 6), однако размер частиц заметно увеличился - до 20 - 80 нм по сравнению с гидрофилизированными НК, что указывает на образование устойчивых кластеров гидрофилизированных НК.

Рис. 5 Интенсивность флуоресценции и положение максимума флуоресценции исходных НК (1), Цис- НК (2), Цис-НК, модифицированных хитозаном (3), поли-L-лизином (4), ПДАДМАХ (5).

Рис. 6 Сравнение и стабильность во времени квантового выхода Цис-НК, Цис-НК, модифицированных хитозаном и поли-L-лизином.

2.2 Модификация НК амфифильными полимерами

Данный способ модификации НК основан на использовании гидрофобных взаимодействий между октильными лигандами ТОФО на поверхности НК и гидрофобными группами амфифильных полимеров. Такой способ позволяет защитить и гидрофилизовать поверхность НК за счет гидрофильных групп амфифильных полимеров, не удаляя ТОФО с поверхности частиц. В отдельных случаях для создания более прочной и стабильной оболочки необходима дополнительная сшивка макромолекул в поверхностном слое диаминами.

В настоящей работе использовали следующие амфифильные полимеры: полиакриламидный конъюгат, содержащий 15% мол. в-галактозы и 10% мол. диолеоилфосфатидилэтаноламина (PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%)), чередующийся сополимер малеинового ангидрида и 1- тетрадецена (СМТ) и моногидрокси(1-меркаптоундецил)тетраэтиленгликоль (МГМТГ).

При модификации НК PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%) и СМТ были получены стабильные дисперсии НК, сохраняющие коллоидную устойчивость в водных средах в течение 3 месяцев, однако диаметр частиц также оказался несколько выше диаметра исходных НК, что свидетельствует об образовании кластеров НК.

Как видно из рис. 7, квантовый выход НК, модифицированных PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%) и СМТ значительно увеличился по сравнению с исходными гидрофобными НК. На основании проведенных экспериментов по гидрофилизации НК было установлено, что прирост квантового выхода сильно зависит от качества НК: относительное увеличение квантового выхода тем больше, чем меньше абсолютное значение квантового выхода исходных НК.

Другой перспективный вариант реализации данного способа модификации НК состоит в использовании МГМТГ, имеющего в составе меркаптогруппу, обеспечивающую связывание с оболочкой НК, гидрофобный фрагмент, имеющий сродство к оболочке НК и облегчающий проникновение меркаптогруппы к поверхности НК, а также гидроксильную группу для коллоидной стабилизации частиц в водных средах и последующего связывания биолигандов.

НК, модифицированные МГМТГ, характеризовались высокой коллоидной устойчивостью в водных растворах и малым размером частиц - 9±1 нм, при этом квантовый выход увеличился в 3 раза по сравнению с исходными гидрофобными НК (рис.7). Также стоит отметить, что данные дисперсии сохраняют свою коллоидную устойчивость в водной среде уже более года с сохранением флуоресцентных характеристик.

Рис. 7 Сравнение квантового выхода и стабильности во времени исходных НК в гексане, Цис-НК и НК, модифицированных СМТ, конъюгатом PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%) и МГМТГ.

Как было отмечено выше, модификация НК тиолсодержащими функциональными молекулами приводит к уменьшению квантового выхода более чем на 10%, при этом красное смещение максимума флуоресценции составляет 5-10 нм. В случае модификации НК амфифильными полимерами (без удаления стабилизирующего лиганда ТОФО с поверхности НК) смещения максимума флуоресценции не происходит.

Таким образом, были получены стабильные флуоресцентные частицы методом модификации НК цистеином и смесью меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота с последующим формированием дополнительного полимерного защитного слоя (хитозан, поли-L-лизин, ПДАДМАХ), характеризующиеся высокими флуоресцентными свойствами. Использование полимеров с целью дополнительной стабилизации НК приводит к некоторому укрупнению частиц, но в то же время к увеличению коллоидной устойчивости и квантового выхода водных дисперсий НК. Однако лучшие результаты по коллоидной стабильности и увеличению квантового выхода демонстрируют НК (кластеры НК), модифицированные амфифильными полимерами (PHEAA-Galв(15%)-DOPE(10%), СМТ, МГМТГ.

Перечень разработанных типов флуоресцентных наноразмерных частиц и их характеристики приведены в сводной таблице 1. НК, модифицированные цистеином, были апробированы для иммунофлуоресцентного мечения клеток, а также в качестве контрастирующих агентов в методе флуоресцентной оптической томографии.

Таблица 1. Характеристики наноразмерных флуоресцентных частиц

3. Инкапсулирование НК в частицы полимерных дисперсий

Следующий вариант модификации заключался во включении гидрофобных НК в частицы полимерных дисперсий, которые нашли широкое применение в качестве носителей биолигандов в различных видах биоанализа. Использование флуоресцентных меток, которые выполняют индикаторную функцию, позволяет визуализировать появление биоспецифических комплексов, что значительно упрощает проведение анализа. Однако, использование традиционных органических красителей в качестве флуоресцентных меток, сопровождается трудоемким процессом подбора условий эффективного введения красителя и получения интенсивного сигнала флуоресценции (подбор природы полимерной матрицы, способа введения, концентрационных зависимостей и т. д.), а также осложняется диффузией красителя из полимерной матрицы в процессе хранения. Кроме того, использование многоцветных оптически кодированных органическими красителями полимерных микрочастиц осложняется сложностью их анализа, требующего несколько источников возбуждения с разными длинами волн. Все вышеуказанное снижает эффективность использования органических красителей в качестве флуоресцентных меток в полимерных дисперсиях.

Таким образом, разработка единообразных подходов к формированию флуоресцентных субмикронных полимерных дисперсий с заданным в зависимости от области применения диапазоном диаметров, узким распределением частиц по размерам (РЧР), наличием функциональных групп на поверхности для образования прочной связи с биолигандами, высокой фотостабильностью, сохраняющих коллоидную устойчивость в широком диапазоне рН и в физиологических средах, а также позволяющих реализовать многопараметрические методы анализа с использованием многоцветного флуоресцентного кодирования, является весьма перспективной задачей.

3.1 Включение НК в полимерную матрицу на основе акролеина

Анализ литературных данных и проведенные исследования показали, что перспективными для биоанализа являются полимерные микросферы на основе акролеина, принципиальным достоинством которых является наличие на их поверхности альдегидных групп, позволяющих в мягких условиях присоединять к их поверхности биологические молекулы.

В зависимости от способа полимеризации и сополимеризации акролеина в водных средах могут быть получены полимерные дисперсии в широком диапазоне диаметров - от 100 до 1,5 мкм с узким РЧР при сохранении коллоидной стабильности. Наличие поверхностных альдегидных групп для прямого ковалентного связывания с биолигандами, контролируемые параметры частиц на стадии синтеза, возможность расширения спектра получаемых частиц и их свойств путем сополимеризации со стиролом и последующим введением в них НК позволит использовать их в качестве флуоресцентных носителей биомолекул для дальнейшего использования в разнообразных диагностических тестах (различные виды РЛА, цитофлуориметрия).