Учреждение Российской академии наук
ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.В.ОВЧИННИКОВА
(ИБХ РАН)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов
специальность - 03.00.23 - биотехнология
кандидата химических наук
Сизова Светлана Викторовна
Москва 2009 г.
Работа выполнена в лаборатории Полимеры для биологии Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук
Научные руководители:
доктор химических наук, профессор Зубов Виталий Павлович
доктор физико-математических наук Олейников Владимир Александрович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
Бовин Николай Владимирович
доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович
Ведущая организация:
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова
Защита состоится « » _________2009 года в ______часов на заседании диссертационного совета при Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Автореферат разослан « » ___________ 2009 г.
нанокристалл полупроводниковый полимерный синтетический
Характеристика работы
Актуальность проблемы. Интенсивное развитие методов анализа, основанных на использовании различных флуоресцентных меток, сделало их одними из важнейших экспериментальных методов во многих научных дисциплинах. В частности, их применение в биотехнологии и медицине привело к появлению и развитию методов, облегчающих изучение живых клеток и клеточных структур, фундаментальных клеточных процессов и методов регистрации биоспецифических взаимодействий, находящих применение в медицинской диагностике и разнообразных биологических анализах.
В последние годы интенсивно разрабатываются подходы к визуализации процессов на уровне клеток, тканей и целых организмов, основанные на введении специализированных флуоресцентных меток. Одними из наиболее перспективных меток нового поколения являются флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы (НК), состоящие из элементов групп II-VI, III-V и имеющие структуру ядро/оболочка.
Полупроводниковым НК присущи два основных достоинства, отличающие их от органических флуорофоров: 1) широкий диапазон узких полос флуоресценции, положение которых зависит от диаметра НК и является управляемым параметром при возможности возбуждения излучением с одной длиной волны; при этом длина волны возбуждения может варьироваться для получения максимального отношения сигнал/шум с учетом конкретного изучаемого объекта; 2) высокая фотостабильность НК, в 100-4000 раз превышающая фотостабильность лучших органических флуорофоров. Такие свойства делают НК перспективными флуоресцентными биомаркерами в анализах, основанных на биоспецифическом взаимодействии «лиганд-рецептор» в разнообразных in vitro и in vivo биоаналитических системах, в которых использование традиционных органических флуорофоров ограничено недостаточной фотостабильностью и невозможностью одновременной регистрации в многопараметрических (многоцветных) системах. Кроме того, такие НК весьма перспективны для создания новых флуоресцентных сенсоров, действие которых основано на использовании эффекта резонансной передачи энергии (FRET-эффект). Химический анализ многокомпонентных смесей, в частности, детектирование наличия в смеси определенных ионов металлов, биологических соединений и т.д., и анализ ряда физических параметров, таких как рН, электрохимический потенциал, температура в наномасштабных областях также является потенциальной областью применения данных сенсоров.
НК состава CdSe/ZnS с диаметром 2-6 нм, используемые в данной работе, являются альтернативой органическим флуоресцентным меткам, традиционно применяемым в биотехнологии и медицине благодаря высокой яркости, возможности регистрировать флуоресценцию по всему оптическому диапазону и доступности. Оболочка из широкозонного полупроводника ZnS предохраняет флуоресцирующее ядро от влияния окружения и позволяет получить НК с квантовым выходом до 70%.
Одной из основных проблем использования таких флуоресцентных НК является трудность получения биосовместимых, легко конъюгируемых с биологическими молекулами флуоресцентных комплексов на их основе, что ограничивает их применение в медицине и биотехнологии в качестве эффективных флуоресцентных биомаркеров и сенсоров. Для решения указанной проблемы в настоящей работе разработан ряд способов модификации и функционализации поверхности НК, а также иммобилизации НК в полимерные матрицы для создания высокоэффективных и специфичных флуоресцентных биомаркеров и продемонстрированы примеры их использования в таких видах биоанализа, как реакция латексной агглютинации (РЛА), проточная цитофлуориметрия, для визуализации клеток и клеточных рецепторов.
Цели и задачи работы. Цель работы заключалась в разработке серии специфичных, биосовместимых, флуоресцентных аналитических реагентов, содержащих флуоресцентные полупроводниковые НК для биотехнологии и их тестировании в биоаналитических методах.
В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:
§ Исследование свойств НК в конденсированных средах.
§ Создание модифицирующих слоев на поверхности НК из синтетических и природных полимеров двумя способами:
1) модификацией поверхности НК бифункциональными тиолсодержащими молекулами путем замещения три-н-октилфосфиноксида (ТОФО), стабилизирующего НК в процессе синтеза, с последующим формированием изолирующего слоя из молекул биополимеров (полипептидов, полисахаридов и т.д.);
2) формированием полимерного слоя вокруг НК посредством гидрофобных взаимодействий c амфифильными полимерами без удаления молекул ТОФО с поверхности НК.
§ Разработка методов включения полупроводниковых НК в полимерную матрицу из синтетических (гомо- и сополимеры акролеина) и природных (наночастицы на основе этилцеллюлозы) полимеров;
§ Получение флуоресцентных реагентов и демонстрация возможностей их использования путем тестирования в биоаналитических методах.
§ Разработка методики получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными максимумами флуоресценции на поверхности оптических стекол - прототипов FRET-зондов для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии.
Научная новизна и практическая ценность работы
Исследованы свойства и поведение гидрофобных НК в конденсированных средах на примере пленок с различной концентрацией НК. Экспериментально установлены оптимальные и предельные концентрации НК в конденсированных средах, при которых не происходит падения квантового выхода и красного сдвига флуоресценции.
Разработаны способы получения флуоресцентных наноразмерных частиц в диапазоне диаметров 5-80 нм, коллоидно устойчивых в водных средах, содержащих функциональные группы путем модификации НК синтетическими и природными полимерами.
Разработаны методы получения флуоресцентных полимерных микросфер, содержащих полупроводниковые НК для различных вариантов биоанализа, которые характеризуются:
§ однотипной полимерной матрицей на основе гомо- и сополимеров акролеина с поверхностными функциональными группами;
§ широким диапазоном размеров частиц (100-500 нм) и узким распределением частиц по размерам;
§ коллоидной и химической стабильностью в широком диапазоне рН и физиологических жидкостях;
§ возможностью введения НК с различными длинами волн испускаемой флуоресценции, а также смесей НК для осуществления многоцветного оптического кодирования полимерных дисперсий;
§ фотостабильностью и высоким квантовым выходом;
§ возможностью возбуждения различных длин волн испускаемой флуоресценции одним монохроматическим источником;
§ единообразным протоколом иммобилизации белковых молекул на поверхности полученных полимерных флуоресцентных миикросфер.
Показана возможность введения НК в дисперсии частиц на основе полимеров природного происхождения на примере наночастиц из этилцеллюлозы.
Разработаны методики получения биоаналитических реагентов путем иммобилизации различных биологических объектов на частицы водных дисперсий НК, а также на полимерные микросферы, наполненные НК.
Продемонстрированы примеры использования данных флуоресцентных биореагентов в таких видах анализа, как РЛА, проточная цитофлуориметрия, для иммунофлуоресцентного мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов.
Разработана методика получения пленок гидрофилизированных НК с двумя различными максимумами флуоресценции на поверхности оптических стекол - прототипов FRET-зондов, обладающих воспроизводимыми флуоресцентными свойствами и высокой трибологической устойчивостью.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Диссертация содержит рисунков и таблицы.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на международной конференции «Лазерная физика и оптические технологии» (Гродно, Белоруссия, 2006), Международной конференции по нанобиотехнологии NACBO (Урбино, Италия, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения» (Белгород, 2006), III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2008 ), 5 московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах.
Содержание работы
1. Исследование свойств НК в конденсированных средах
Основой многих сенсорных систем для многопараметрического анализа многих объектов, являются упорядоченные 2-х (планарные микрочипы) или 3-х мерные структуры (жидкие чипы на основе коллоидных спектрально кодированных микрочастиц). При создании таких систем на основе полупроводниковых CdSe/ZnS нанокристаллов в обоих случаях важно понимание - как изменяются свойства НК в конденсированных средах.
Для изучения свойств НК в конденсированных средах была разработана методика формирования пленок из НК на твердой подложке (оптические стекла). Были сформированы (1) пленки с предельно высокой концентрацией НК со средним расстоянием между НК ~ 4 нм, что соответствует плотной гексагональной упаковке НК, покрытых монослоем ТОФО и объемной концентрации 1.5*1019 см-3 и (2) пленки, представляющие собой НК, распределенные в матрице ТОФО со средним расстоянием 9 нм, что соответствует объемной концентрации 1.3*1018 см-3. Измерения среднего расстояния между НК осуществляли методом АСМ.
Рис. 1. Спектры поглощения (сплошная) и флуоресценции (пунктир) раствора и пленок CdSe/ZnS НК диаметром 4 нм. (1) Раствор НК гексане. (2) Пленка с "низкой" плотностью НК (объемная концентрация 1.3*1018 см-3). (3) Пленка с "высокой" плотностью НК (концентрация 1.5*1019 см-3). Точечной линией показана длина волны возбуждающего излучения. Толщина пленок - 100 монослоев.
Спектры поглощения и флуоресценции пленок НК размером 4 нм представлены на Рис.1, 2. Видно, что для пленок с высокой концентрацией НК спектры поглощения и флуоресценции испытывают сильный сдвиг в красную область по сравнению с дисперсией НК и пленками с низкой концентрацией НК, что свидетельствует о достаточно сильном взаимодействии между НК и, как следствие, о смещении положения максимума флуоресценции пленок НК. Было обнаружено, что по мере увеличения плотности пленки положение максимума спектра флуоресценции сдвигается в красную область, при этом ширина пика флуоресценции и поглощения практически не зависит от толщины пленки. Таким образом, данные результаты показывают, что даже при минимальном расстоянии между НК в формируемых пленках наблюдается эффект размерного квантования. При этом параметры флуоресценции и поглощения поверхностных конденсатов НК определяются расстояниями между НК.
Сравнение флуоресценции пленок НК и красителей родаминового ряда показало, что в конденсированной фазе квантовый выход флуоресценции НК на два порядка превосходит квантовый выход флуоресценции красителя (Рис. 2).