Ряд работ посвящен изучению иммуномодулирующих свойств гуминовых веществ. Считается, что иммуномодулирующие свойства гуминовых кислот реализуются за счет стимуляции синтеза интерферона и TNF в крови (Inglot A.D. et al., 1999), повышения фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов (Jancowski A. et al., 1996), снижения антигензависимой выработки иммуноглобулина Е и гистамина. Показано, что гуминовые соединения оказывают дозозависимый эффект на такие иммунологические показатели, как количество Т-лимфоцитов, соотношение их основных субпопуляций (Madey J.A. et al., 1995), спонтанную и индуцированную ФГАЗ экспрессию рецепторов для ИЛ-2, а также на синтез моноцитами ИЛ-1 и ФНО. Гуминовые кислоты стимулируют синтез ИФН и ИФН периферическими лейкоцитами. Предполагают, что иммуностимулирующий механизм действия гуматов реализуется через ферменты аденилатциклазного комплекса (Уразаев Д.Н. с соавт., 2000). Стимулирующий эффект объясняется одновременной активацией аденилатциклазы и ингибированием фосфодиэстеразы, что сопровождается увеличением концентрации внутриклеточной цАМФ. В свою очередь цАМФ активирует 2, 5 - олигоаденилатсинтетазу. На основании полученных результатов авторы делают вывод об индукции гуминовыми кислотами интерфероноподобного эффекта в клетках.
Антиоксидантные свойства гуминовых соединений связаны с их способностью уменьшать выработку MDA (Piotrowska D. et al., 2000). При этом антиоксидантная активность гуминовых соединений приравнивается к таковой витамина Е.
В лабораторных исследованиях обнаружена комплексообразовательная способность гуминовых веществ по отношению к таким ионам тяжелых металлов как медь, кадмий, свинец. Комплексообразование осуществляется путем ингибирования ионов специфичными для металлов ферментами клеток (Glunn A.Y., 1996).
Установлено отсутствие влияния гуминовых кислот на факторы свертывания крови, на длительность кровотечения, время свертывания, тромбиновое и протромбиновое время, концентрацию фибриногена, количество тромбоцитов и их агрегацию (Buczko W. et al., 1995). Вместе с тем гуминовые соединения оказывают антианемическое действие, проявляющееся быстрым увеличением количества эритроцитов за счет стимуляции эритроидного ростка системы кроветворения и ускоренной дифференцировкой активированных эритробластов в эритроциты. Гуминовые кислоты нивелируют у подопытных животных нарушенный в эксперименте обмен веществ и кислотно-щелочное равновесие (Banaczkiewicz W. et al., 1996).
Демин В.В. с соавторами (2004) сформулировали гипотезу относительно патогенеза позитивного действия гуминовых веществ. Сущность гипотезы заключается в следующем. Гуминовые кислоты сорбируются на наружной поверхности цитоплазматических мембран клеток, образуя «ажурную сетку», свободно пропускающую в цитоплазму клетки элементы минерального происхождения и низкомолекулярные органические соединения. Одновременно они прочно связывают токсичные для клетки ионы тяжелых металлов и свободные радикалы, присутствующие во внешней среде. Подобное избирательное связывание токсических веществ снижает энергозатраты клетки на устранение негативного эффекта, вызванного проникновением ксенобиотиков во внутриклеточную среду. В итоге увеличивается устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Высвобождаемая при этом энергия направляется на интенсификацию процессов клеточного деления, реализуемых ускорением развития организма.
Необходимо учитывать, что эффект, оказываемый гуминовыми веществами, во многом определяется их макро- и микроэлементным составом, способом получения и характером торфяников. Изучаемый авторами препарат, содержащий в своей основе гуминовые соединения, получен путем водного экстрагирования из торфов Верхне-Волжского региона в лаборатории, возглавляемой д.т.н., профессором Ю.А. Калинниковым (Институт химии растворов РАН). Препарат представляет собой раствор без вкуса и запаха, темно-бурой окраски, содержащий гуминовые соединения и следующий набор микроэлементов: Fe, Na, Mg, K, Mn, Cu.
По данным элементного анализа содержание основных элементов в сухом препарате гумусовых кислот составляет: С - 45.2 %, Н - 4.9 %, О - 34.3 %, N - 6.1%, S - 0.5%.
По данным атомно-абсорбционной спектроскопии содержание микроэлементов в мкг/мл: Fe - 1.9, Na - 0.3, Mg - 0.06, Mn - 0.01, Zn - 0.02.
Содержание основных кислородсодержащих функциональных групп в гумусовых кислотах (в мэкв/г): общая кислотность - 9.5, карбоксильные - 5.3, фенольные гидроксилы - 4.2, карбонильные - 17.6, хинонные - 1.35
Таким образом, препарат является принципиально новым, поэтому актуальность изучения его влияния на живые организмы не вызывает сомнения.
1.2. Методы исследования
В эксперименте использованы 16 лабораторных беременных крыс линии Вистар, 98 плодов и их последов, полученных от самок.
У всех самок создавали модель недостаточности МПК по методу Н.Л. Гармашевой и Н.Н. Константиновой (1978). На 15 день беременности у крыс лигировали 1/3 пучка преплацентарных артерий у каждого плодовместилища левого рога матки. Преплацентарные артерии и плоды правого маточного рога оставались интактными. Экспериментальное нарушение маточно-плацентарного кровообращения (МПК) у животных проводили под этаминал-натриевым наркозом в дозе 40 мг/кг.
От самок (n=8), получавших на протяжении всей беременности чистую воду в стандартных поилках, получено 30 плодов и последов из интактного правого маточного рога, составивших группу контроля (1 группа). Плоды (30) и последы (30) из левого маточного рога с лигированными преплацентарными артериями составили группу сравнения (2 группа) с экспериментально нарушенным маточно-плацентарным кровообращением.
От крыс (n=8), получавших per os гуминовые соединения, с водой в стандартных поилках, в дозе 10 мг/кг массы тела в течение всей беременности, из маточного рога с лигированными преплацентарными артериями получено 38 плодов и последов, которые составили основную группу с коррекцией нарушений маточно-плацентарного кровообращения гуминовыми соединениями (3 группа). Во всех трех группах кроме плодов и последов изучались сегменты маточных рогов и плацентарное ложе.
На втором этапе эксперимента с целью изучения морфологических изменений в тимусе, селезенке и надпочечниках потомства использовано 20 крыс линии Вистар и 196 плодов. Согласно цели исследования, экспериментальные животные были разделены на 2 группы: 1 группа - интактные беременные крысы, контроль (n=10); 2 группа - самки, получавшие гуминовые соединения (n=10). От самок из группы контроля получено 92 плода, от самок из опытной - 104 плода.
На 21 день беременности, за день до предполагаемых родов, проводили эвтаназию животных с помощью этаминал-натрия в дозе 60 мг/кг, затем осуществляли аутопсию самок и плодов.
Для оценки выраженности токсического действия гуминовых соединений рассчитывали следующие показатели:
· преимплантационную гибель - количество желтых тел в яичниках, относительно числа мест имплантации яйцеклеток в матке;
· постимплантационную гибель - количество участков резорбции яйцеклеток в матке, относительно общего числа мест имплантации;
· плодовитость крыс, вес крысят и наличие видимых уродств.
Проведено комплексное морфологическое исследование последов, тимусов, селезенок и надпочечников плодов на органном, тканевом и клеточном уровнях, включающее следующие методы:
макроскопическое изучение последов;
соматометрия плодов;
органометрия: линейные параметры органов, масса, объем, площадь материнской поверхности последов;
обзорная гистология (окраска гематоксилином и эозином);
гистостереометрия (100- точечной сеткой по 6 линиям сканирования и с помощью автоматизированной программы Видео-ТесТ Мастер «Морфология 4.0»);
гистохимические методы (окраска по методу ван-Гизона, Браше, Фельгена, PAS-реакция по Мак-Манусу);
иммуногистохимическое исследование плаценты и плацентарного ложа с выявлением васкуло-эндотелиального фактора роста и фактора Виллебранда;
полутонкие срезы (окраска метиленовым синим и метил-азур II фуксином);
трансмиссионная электронная микроскопия.
Статистическая обработка полученных результатов исследования выполнена с помощью программного обеспечения «Excel». Предварительно определяли тип распределения вариационного ряда. При нормальном распределении вычисляли средние арифметические значения, ошибки средних арифметических. Достоверность различий сравниваемых средних величин определяли на основании t-критерия Стьюдента.
1.3 Патоморфология последов крыс в условиях нарушенного маточно-плацентарного кровообращения
Плаценты при нарушении маточно-плацентарного кровообращения в эксперименте губчатой консистенции, розово-красного цвета в 86,7% случаев овальной формы. Конфигурация органа в 13,3% неправильная - многоугольная. Материнская поверхность органов темно-красная с мелкоточечными кровоизлияниями. В отличие от нее плодовая поверхность цианотичная, в 40% случаев с плотным белесоватым ободком по периферии. Пупочный канатик в большинстве случаев с парацентральным прикреплением. Сосуды пуповины резко полнокровны, умеренно извиты. Внеплацентарные оболочки бледно-серые, полупрозрачные с полнокровными сосудами.
Органометрические параметры плаценты и длина пуповины достоверно снижены по сравнению с группой контроля (табл. 1).
При гистологическом исследовании в базальной части плацент крыс, преимущественно в краевых отделах, выявлен тромбоз материнских сосудов с количественным преобладанием париетальных тромбов и единичными обтурирующими. Локализация тромбов объясняется тем фактом, что в эксперименте проводили лигирование преимущественно латеральной части пучка. Периваскулярно обнаруживаются инфильтраты из полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов. Базофильные клетки базального отдела плаценты с очаговой альтерацией в виде пикноза ядер и вакуолизацией цитоплазмы. Единичные гликогеновые клетки или их очаговые скопления, особенно в периваскулярных зонах, чаще с резко вакуолизированной цитоплазмой, реже в состоянии некробиоза, некроза и явлениями кариорексиса и лизиса. Цитоплазма клеток дает отрицательную PAS-реакцию. Кроме того, в базальном отделе значительно увеличены периваскулярные и перицеллюлярные отложения фибриноида. Участки фибриноидного некроза в местах перехода в децидуальную ткань значительно расширены. В краевых отделах лабиринтной части плаценты субхориально встречаются зоны ишемии ткани, представленные пустыми и спавшимися материнскими лакунами. Площади материнских лакун достоверно снижена по сравнению с контролем (р<0,001; табл. 2). Напротив, материнские синусы центральных отделов дилятированы, полнокровны с явлениями стаза и сладжирования эритроцитов в них. Площадь плодовых капилляров достоверно уменьшена во всех отделах (р<0,001; табл. 2). В капиллярах наблюдается стаз эритроцитов. Среди трофобласта лабиринтного отдела, разделяющего материнский и плодовый кровоток, встречаются клетки с вакуолизированными ядрами.
Гистостереометрическое исследование выявило достоверное снижение удельного объема материнского (материнские синусы, сосуды базального отдела) и плодового сосудистого русла за счет увеличения доли фибриноида и таких патологических очагов как тромбозы материнских артерий, сладжирование эритроцитов, периваскулярное воспаление, альтерационные изменения структур последа (табл. 3).
Структурные компоненты амниотической оболочки, как эпителий, так и строма, в состоянии альтерации, которая завершается расширением полосы фибриноидного некроза и разрушением апикальной части клеток амниотического эпителия. В последних обнаружены мелкие PAS-положительные гранулы.
Среди артерий плацентарного ложа матки в соотношении 1:3 встречаются сосуды с неполной гестационной перестройкой стенки. Последняя истончена и представлена пучками гладкомышечных и коллагеновых волокон. Такие артерии имеют узкий щелевидный просвет. Число сосудов плацентарного ложа на единицу площади составляет 5,0±0,31 мм 2.
При иммуногистохимическом исследовании выявлено, что фактор Виллебранда локализуется в эндотелии материнских сосудов, периваскулярных базофильных клетках базального отдела, а также в клетках трофобласта лабиринтного отдела плаценты. При этом количество позитивных клеток составляет 80-100%, а средний гистохимический коэффициент достоверно превышает контрольные значения (табл. 4). В плацентарном ложе имеется тенденция к увеличению фактора Виллебранда в эндотелиоцитах сосудов микроциркуляторго русла по сравнению с контрольной группой.
Позитивная реакция с васкуло-эндотелиальным фактором роста наблюдается лишь в 30-40% базофильных клеток плаценты и таком же количестве децидуальных клеток плацентарного ложа. Выраженность реакции достоверно ниже контрольных значений (табл. 5).
Следовательно, развивающиеся при нарушении маточно-плацентар-ного кровообращения в эксперименте расстройства кровообращения в виде тромбозов артерий базального отдела, ишемии краевых отделов лабиринта и деструкции структурных компонентов последа с увеличением доли фибриноида, некробиозом-некрозом клеток базального и лабиринтного отделов являются морфологическим субстратом плацентарной недостаточности. Адаптивные процессы, проявляющиеся гиперемией материнских синусоидов центральных отделов плацент, являются неэффективными вследствие развивающихся стазов и сладжирования эритроцитов. Повышение уровня фактора Виллебранда, являющегося индикатором повреждения эндотелия, и уменьшение васкуло-эндотелиального фактора роста свидетельствуют об эндотелиальной дисфункции и нарушениях ангиогенеза в плацентах и плацентарном ложе. Следствием сформированной плацентарной недостаточности является отставание плода в своем развитии от срока гестации, что подтверждается достоверным снижением его соматометрических показателей по сравнению с контролем (табл. 6).
1.4 Структурные перестройки в последах при коррекции гуминовыми соединениями экспериментальных нарушений маточно-плацентарного кровообращения
В группе с коррекцией экспериментального нарушения маточно-плацентарного кровообращения природными гуминовыми соединениями, получено 38 плодов и последов. Плаценты округлой (64,2%) и овальной (15,8%) формы, губчатой консистенции, темно-красного цвета. Пупочный канатик с центральным и парацентральным прикреплением, сосуды умеренно полнокровны. Масса, объем плацент, а также длина пупочного кантика достоверно выше показателей 2 группы (табл. 1)