8.Методы выделения чистых культур анаэробных бактерий.

Чистой культурой МО называют культуру одного вида, выращенного как потомство одной клетки. Методы выделения чистых культур МО основаны на изоляции одной микробной клетки от массы МО и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.

Наиболее распространенным способом выделения чистых культур является посев смеси микробов на плотные питательные смеси с целью получения отдельных колоний культур, которые считают результатом развития одной клетки. Для посева чаще используют агаризованные Среды в чашках Петри. Основной задачей метода является разведении концентрации МО в исследуемом материале с таким расчетом , чтобы при посеве его на питательную среду выросли изолированные колонии. Существуют два основных метода разведения исследуемого материала: 1) на поверхности плотной питательной Среды; 2) предварительное разведение материала в физиологическом растворе.

Метод на поверхности плотной Среды используется для выделения чистых культур аэробных, факультативно анаэробных МО. С этой целью для посева берут ряд чашек Петри с плотной средой. В первую чашку наносят исследуемый материал и распределяют его по поверхности шпателем. Затем производят посев последовательно на поверхность Среды в остальных чашках. Количество материала, внесенного в среду, при этом последовательно убывает. Метод предварительного разведения используется для выделения чистых культур МО как аэробных, так и анаэробных. Готовят разведение материалов 10-100 раз и более и производят посев разведений, пользуясь поверхностным или глубинным методом.

Выделение чистых культур строгих анаэробов требует условий выращивания без доступа кислорода.

9.Классификация микробиологических питательных сред.

Для выращивания бактерий применяют различные питательные среды. Они могут быть жидкими, плотными или полужидкими. По происхождению среды делят на естественные (кровяные, молочные, яичные) и искусственные, получившие особенно широкое распространение. Они представляют собой искусственные сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения МО. Питательные среды должны обязательно отвечать пяти основным требованиям:

1)они должны содержать все необходимые питательные вещества, соли и витамины;

2)должны иметь оптимальную для роста данного вида бактерий рН;

3)должны иметь достаточную влажность (при их усыхании повышается концентрация питательных веществ, особенно солей, до уровней, тормозящих рост бактерий).

4)должны быть стерильными и прозрачными;

5)должны быть изотоничными.

По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории.

Универсальные — среды, на которых хорошо растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. К ним относятся: МПБ = мясная вода + 1 % пептона + 0,5 % NaCl, МПА = МПБ + 2-3 % агара).

Дифференциально-диагностические — среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других, построены на биохим. св-вах бактерий, разл. виды бактерий растут в виде окрашенных или неокрашенных колоний.(Среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса)

Селективные — среды, содержащие вещества, используемые МО определенных видов и препятствующие росту других МО. Селективные среды позволяют направленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий. (Среды Мюллера, Рапопорт, 1 %-ная пептонная вода, желчный бульон)

Специальные — среды, специально приготовленные для получения роста тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. (Кровяные, сахарные, сывороточные).

10.Структура и особенности биологии вирусов. Критерии классификации вирусов.

Основные свойства вирусов, по которым они отличаются от всех остальных живых существ:

1.Ультрамикроскопические размеры.

2.Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа — или ДНК, или РНК.

3.Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4.Вопроизведение вирусов осуществляется только из 1 НК.

5.У вирусов отсутствуют собственные энергообразующие сис-мы.

6.У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем (нет рибосом).

7.В связи с отсутствием энергообразующих и белоксинтезирующих систем, вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Средой обитания вирусов являются бактерии, клетки растений, животных и человека.

С учетом перечисленных особенностей вирусам можно дать следующее определение: вирусы — особое царство ультрамикроскопических размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных энергообразующих и белоксинтезирующих систем, и являющихся поэтому абсолютными внутриклеточными паразитами.

Структура вирусов.

Вирусы не имеют клеточного строения. Имеют уникальный геном, т.к. содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы.

Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы. У просто устроенных вирусов НК связана с белковой оболочкой, называемой капсидом, состоящим из капсомеров. НК и капсид, взаимодействуя друг с другом, образуют нуклеокапсид. У сложно устроенных вирусов имеется суперкапсид – наружная оболочка вируса, состоящая из ЦПМ хозяйской клетки, захваченной вирусом, со встроенными в неё вирусоспецифическими белками и гликопротеидами. Для вирионов характерен спиральный, кубический и сложный тип симметрии капсида.

Критерии классификации вирусов:

1.Нуклеиновая кислота: тип, число нитей, процентное содержание, молекулярная масса, сумма гуанина и цитозина.

2.Морфология: тип симметрии, число капсомеров, форма, размеры вирионов.

3.Биофизические свойства: константа седиментации, плавучая плотность.

4.Белки: количество структурных белков, их локализация, аминокислотный состав.

5.Липидный состав.

6.Размножение в тканевых культурах, особенности репликации.

7.Круг поражаемых хозяев, особенности патогенеза инфекционного процесса; онкогенные свойства.

8.Устойчивость к физическим и химическим факторам (гамма-лучи, термоинактивация при 37 и 50 °С, действие жирорастворителей).

9.Антигенные свойства.

11. Этапы взаимодействия вируса с клеткой-хозяином.

В результате взаимодействия вируса с клеткой развивается либо продуктивная, либо абортивная, либо интегративная форма клеточной инфекции. При продуктивной форме происходит размножение, репродукция вируса. При абортивной форме – её нарушение на одном из этапов. При интегративной – интеграция вирусной НК в клеточный геном (вирогения).

Продуктивный тип взаимодействия:

1-я стадия – адсорбция – прикрепление вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой гликопротеины клеточной мембраны. Первый этап адсорбции определяется неспецифическими силами межмолекулярного притяжения, второй – специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов.

2-я стадия – проникновение вируса в клетку хозяина - происходит путём виропексиса и слияния мембран. Виропексис представляет собой инвагинацию участка плазматической мембраны, где имеются углубления, покрытые рецепторами снаружи, на которых адсорбируется вирус.Затем происходит образование вакуоли вокруг вируса, в составе которой он находится в цитоплазме клетки хозяина. При слиянии мембран вирусная оболочка сливается с плазматической мембраной клетки хозяина, в результате чего внутренние структуры вириона оказываются в цитоплазме заражённой клетки, а при слиянии с ядерной мембраной – в клеточном ядре.

3-я стадия – «раздевание» вирионов – заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождения внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс.

4-я стадия – заключается в транскрипции и репликации вирусных геномов. Основные схемы реализации вирусной генетической информации могут быть представлены следующим образом:

• Д ля ДНК-содержащих вирусов: ДНК вируса иРНК белок вируса;

• Д ля РНК-содержащих минус-нитевых вирусов: РНК вируса иРНК белок вируса;

• Д ля РНК-содержащих плюс-нитевых вирусов: РНК вируса белок вируса;

• Д ля РНК-содержащих ретровирусов: РНК вируса комплементарная ДНК иРНК белок вируса

5-я стадия – сборка вириона – формирование вирусов явл. многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм. Сборка состоит прежде всего в образовании нуклеокапсидов. Формирование вирусов происходит на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки. Слжно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).

6-я стадия – выход вирусных частиц из клетки – происходит двумя путями.Простые вирусы, лишённые суперкапсида, вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Др. вирусы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путём почкования, в результате чего в течение длительного времени она сохраняет свою жизнеспособность.

Интегративный тип взаимодействия:

Вирогения характеризуется встраиванием НК вируса в хромосому клетки. При этом вирусный геном реплицируется и функционирует как составная часть клеточного генома. В случае ДНК-содержащих вирусов – вирусная ДНК в кольцевой форме интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов включение РНК в клеточный геном происходит путём обратной транскрипции.

12. Бактериофаги. Умеренные и вирулентные фаги. Лизогения. Практическое значение бактериофагов.

Бактериофаги - вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их растворение. Имеют форму головастика, кубическую или нитевидную. Форма головастика: головка с ДНК, хвостовой отросток с полым цилиндрическим стержнем, сообщающимся с головкой, снаружи – чехол (для сокращения), базальная пластинка с шипами, от кот. отходят фибриллы.

По механизму взаимодействия фага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги – проникнув в бакт. клетку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Фаги, имеющие хвостовой отросток, адсорбируются на поверхности бакт. кл. с помощью фибрилл. Активируется фаговый фермент АТФаза и сокращается чехол хвостового отростка и в кл. внедряется стержень. ДНК фага впрыскивается в цитоплазму клетки. Разрушается КС бакт. под действием лизоцима и внутриклет. осмотического давления, происходит выход фагового потомства в окр. среду и лизис бактерий. Умеренные фаги лизируют не все клетки, с некоторыми вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геном фага называют профаг.

Лизогения – симбиоз микроба с умеренным фагом.

Практическое значение бактериофагов:

1). Для идентификации выделенных культур МО. (Опр. вида и фаговара)

2).Для оценки сан. состояния окр. среды и эпидемиологического анализа.

3).Для фагопрофилактики и фаготерапии (лечение дисбактериозов). Способы введения в организм: местно, энтерально и парентерально. 3 лек. формы: жидкая форма (фаголизаты) 10-20 мл. Таблетки с пектиновым покрытием. Ректальные свечи.

13.Роль биотехнологии и генной инженерии в получении иммунобиологиче­ских препаратов.

Биотехнология - наука, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов, главным образом микроорганизмов, животных и растительных клеток, использует эти биологические процессы, а также сами биологические объекты для промышленного производства продуктов, необходимых для жизни человека или воспроизводства биоэффектов, не проявляющихся в естественных условиях

Например, для получения инсулина используется поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней, гормона роста - гипофизы трупов человека, иммуноглобулинов - организм лошадей и других животных, препаратов крови - кровь доноров.

Методом генной инженерии созданы сотни препаратов медицинского и ветеринарного назначения. Уже используются в медицине полученные методом генной инженерии вакцины против гепатита В, инсулин, гормоны роста, интерфероны α, β, γ, фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, эритропоэтин, антигены ВИЧ, фактор свертывания крови, моноклональные антитела и многие антигены для диагностических целей.

14. Нормальная микрофлора организма человека и ее значение. Дисбактериозы и причины их возникновения, принципы коррекции.

Наиболее обильно заселены МО толстый кишечник и полость рта.

Нормальная микрофлора толстого кишечника:

А. Основная микрофлора:

1. Аспорогенная анаэробная микрофлора (бифидобактерии (Г+) и бактероиды (Г-)) – 96-99%;

2. Факультативные анаэробы ( энтерококки, лактобактерии, кишечная палочка) – 1-4%.

Б. Остаточная микрофлора – 0,001-0,01%

Нормальная микрофлора полости рта:

Среди микробов полости рта встречаются иммигранты из носоглотки, кишечника и заносная микрофлора из окружающей среды (бактерии, грибы, простейшие, вирусы).

Имеются кокки: зеленящие стрептококки, которые принимают активное участие в процессах, приводящих к поражениям твёрдой ткани зуба и пародонта; пептококки; вейллонеллы, способные оказывать противокариозное действие.

: лактобактерии, способствующие развитию кариеса; актиномицеты, способные принимать Г+ палочки участие в развитии кариеса и заболеваний пародонта; бифидобактерии.

Г- палочки: бактероиды, фузобактерии, лептотрихи

Спирохеты: Трепонемы, Борреллии, Лептоспиры.

Функции нормальной микрофлоры толстого кишечника:

• Колонизационная резистентность;

• Угнетает рост патогенной и гнилостной микрофлоры;

• Стимулирует лимфоидную ткань;

• Участвует в пищеварении;

• Снабжает организм водорастворимыми витаминами и аминокислотами.

Дисбактериоз (дисмикробиоценоз) – любые изменения качественного и количественного состава микрофлоры биотопов человека. (Резкое возрастание кишечной палочки и резкое снижение лактобактерий, рост количества остаточной микрофлоры).

Дисбактериоз появляется при длительном применении АБ и антисептиков, развивается также в случаях снижения местного и общего иммунитета, вызванного радио-, гормонотерапией, применением иммунодепрессантов, местными и общими инфекционными болезнями, особенно хроническими.

Применяют: Бифидобактерин, обладающий антагонистической активностью к остаточной микрофлоре (сухой в ампулах), Лактобактерин, для лечения дисбактериозов у детей, Хилак-форте – пробиотик, продукт жизнедеятельности молочно-кислых бактерий.