Автореферат: Митохондрии как центральное звено повреждающих и защитных сигнальных путей при развитии почечной недостаточности

Рис. 18. Ишемическая зона (стрелка) в почке, визуализированная с помощью МРТ, сохраняется до 30 мин реперфузии. Рис. 19. Ишемическая зона (стрелка) в почке, визуализированная с помощью МРТ, после предобработки SkQR1 исчезает к 30 мин реперфузии.

В ишемизированной почке происходит значительное снижение интенсивности МР-сигнала в корковой зоне почки по сравнению с контролем (рис. 18). Это свидетельствует о нарушении гемодинамики и тока первичной мочи в канальцах. В ходе последующей реперфузии наблюдается постепенное, но достаточно быстрое восстановление нормальной МР-плотности ткани почки (рис. 18). Кроме того, обнаружено, что с помощью МР-сканирования мы можем оценивать наполненность магистральных и других крупных кровеносных сосудов почки. Этот признак может быть информативным для оценки действия препаратов, поскольку вазоконстрикция является одним из серьезных последствий ишемии и первостепенным повреждающим фактором.

При исследовании влияния введения антиоксиданта SkQR1 за сутки до ишемии было выявлено его влияние на гемодинамику в поврежденной почке. В частности, ишемизированная зона, видимая на томографических изображениях в виде затемнения паренхимы почки, при введении SkQR1 исчезала уже к 30 мин реперфузии, тогда как без обработки антиоксидантом эта зона продолжала выявляться на 30 мин реперфузии (рис. 19).

Аналогичные изменения выявлены в наполненности магистральных сосудов почки. Так, после ишемии происходила значительная вазоконстрикция, и сосуды в большинстве случаев не выявлялись на МРТ-изображениях, что указывает на сужение их просвета. В то же время при введении 1 мкмоль/кг SkQR1 за сутки до ишемии сужение просвета сосудов было выражено в значительно меньшей степени.

Клеточная терапия острой и хронической почечной недостаточности

Наши исследования показывают, что ни один из исследованных способов нефропротекции не способен обеспечить абсолютное восстановление почки при различных нефропатиях, поэтому очевидно, что для получения оптимального эффекта в клинике необходимо одновременное применение широкого арсенала средств нефропротекции. Одним из широко исследуемых сейчас направлений является клеточная терапия различных заболеваний с помощью стволовых и прогениторных клеток. Поэтому в следующей части работы исследовали возможности клеточной терапии различных типов почечной недостаточности с помощью введения мультипотентныхмезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и фетальных почечных прогениторных клеток (ППК).

Таблица 3. Влияние интрапаренхиматозного введения стволовых клеток на динамику функции почки у крыс с постишемической ОПН.

Мы обнаружили, что интрапаренхиматозное введение культивированных как клеток почки, так и ММСК достоверно улучшает функциональное состояние почек у крыс с ХПН, способствуя нормализации функциональных показателей в пределах 2-х нед (табл. 2). Стимулирующий эффект у всех животных сохранялся более 1 мес. Существенной разницы в динамике восстановления функции поврежденной почки в опытах с использованием почечных клеток и мезенхимальных стволовых клеток не выявлено (табл. 2).

При пост-ишемической ОПН введение в паренхиму почки ППК существенно не влияло на развитие почечной недостаточности, тогда как введение ММСК достоверно ускоряло восстановление функциональной активности ишемизированной почки и предотвращало гибель животных от почечной недостаточности.

После 90-минутной тепловой ишемии единственной почки все крысы гибли при явлениях уремии на 2-3 сут после моделирования ОПН. При введении ППК также погибло большинство крыс, причем гибель животных происходила на 1-2 сут. После пересадки ММСК ни одна из 10 крыс не погибла от уремии. Показатели функции почки у выживших крыс восстанавливались до нормальных значений через 1-2 мес, за исключением канальцевой реабсорбции натрия, которая нормализовалась уже через 2 нед. При введении ММСК достоверно лучшие показатели функционального состояния ишемизированной почки отмечались уже на ранних сроках пост-ишемического периода (табл. 3).

При гистологическом исследовании почек после ишемии в корковом веществе выявляли участки с полной деструкцией почечных структур разной площади. В дистальных извитых канальцах у подавляющего большинства эпителиоцитов цитоплазма вакуолизирована за счет гидропической дистрофии вплоть до фокального клеточного некроза (рис. 20А). В целом гистологическая картина соответствует выраженному острому канальцевому некрозу.

В опытах с интрапаренхиматозным введением ММСК на 4-е сутки очагов деструкции почечных структур не отмечено. Наряду с участками гидропической дистрофии эпителия канальцев, выявляются зоны, в которых канальцы нефрона выстланы набухшими эпителиоцитами, суженным просветом и базальным расположенными обычного вида ядрами (рис. 20Б). Такая гистологическая картина, по всей видимости, является проявлением повышенной функциональной активности этих структур почки.

Через 1 мес после ишемии с введением ММСК отмечалось значительное уменьшение площади участков с морфологическими проявлениями повышенной функциональной активности канальцевого эпителия. Эпителий большинства канальцев сохранял признаки гидропической дистрофии. В отдельных канальцах отмечалась кальцификация погибших эпителиоцитов (рис. 20В). Через 3 мес после перенесенной ишемии патологические изменения минимизируются.

Таблица 2. Влияние интрапаренхиматозного введения стволовых клеток на функцию почек крыс ХПН.

Для уточнения вопроса, связано ли терапевтическое действие ММСК при постишемической ОПН с интеграцией пересаженных клеток в почечные структуры или оно обусловлено их паракринным влиянием, в части опытов мы инъецировали в почку ММСК, нагруженные флуоресцентным красителем Calcein-АМ. При исследовании срезов почки через 1 сут выявляли наличие флуоресцирующих ММСК в месте инъекции и в прилежащих областях (рис. 21А).

Рис. 20. Гистология почечной ткани, окраска гематоксилином и эозином. После ишемии наблюдается гидропическая дистрофия эпителия почечных канальцев с явлениями фокального некроза эпителиоцитов (А, белые стрелки). После ишемии почки и интрапаренхиматозного введения МСК выявляются участки с повышенной функциональной активностью (Б, черные стрелки). Улучшение гистологической картины через месяц после ишемии почки и введения МСК, кальцификация отдельных эпителиоцитов (В, фигурная стрелка).

Меченые клетки выявлялись лишь в интерстициальном пространстве ткани почки, причем даже на достаточно большом расстоянии от зоны введения, и не определялись в канальцах. В более отдаленные сроки (7 сут) после трансплантации, меченные калцеином клетки по-прежнему выявлялись в почке, однако их распределение по интерстицию было еще более диффузным. Не выявлялось группирования клеток в месте инъекции, число клеток, выявляемых на одном срезе, было значительно меньше (рис. 21Б), чем в первые сутки. При этом происходила миграция ММСК на большие расстояния от места инъекции практически по всей паренхиме почки, что подтверждалось анализом серийных срезов почки.

В отдельной серии экспериментов была определена эффективность клеточной терапии для лечения ОПН и ХПН при внутривенном введении клеток, что более соответствует потребностям клинического применения. Введение крысам с ХПН как культивированных ММСК, так и культивированных ППК приводило к постепенному улучшению всех функциональных параметров. Динамика восстановления была быстрее в опытах с трансплантацией ППК. В этих экспериментах уже через 2 недели происходила нормализация всех функциональных показателей, и они держались в пределах нормы более 2 мес. В экспериментах с введением ММСК улучшение функционального состояния почек происходило медленнее: для достижения нормальных или субнормальных значений требовалось более 1 мес.

Рис. 21. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки через 1 сут (А) и 7 сут (Б) после И/Р почки и интрапаренхиматозного введения МСК, меченых Calcein. Дополнительная окраска срезов флуоресцентным зондом TMRE. Видно распространение введенных клеток (зеленая флуоресценция) по интерстицию почки между почечными канальцами (красная флуоресценция, принадлежащая митохондриям почечного эпителия). Стрелкой указано место введения клеток. Шкала 100 мкм.

Выживаемость крыс после введения ППК составила 50%, а после введения ММСК - 83%. Оценка динамики функциональных показателей состояния почки у выживших крыс показала, что в опытах с внутривенным введением ППК нормализация функции почки происходила уже через 2 недели после ишемического воздействия, а при введении ММСК - через 3 недели. Снижение концентрации креатинина крови после введения обоих видов клеток происходило почти одинаково, тогда как снижение концентрации мочевины было заметно более медленным в опытах с введением ММСК. В отдаленные сроки в обеих группах концентрация мочевины в крови несколько повышалась, превышая ее концентрацию у интактных крыс. Клиренс креатинина в опытах с ППК на 4-е сутки снижался в меньшей степени, чем в опытах с ММСК, в последующем стабилизируясь в пределах нормы. Реабсорбция ионов натрия в почечных канальцах после введения ППК также снижалась в меньшей степени, чем после введения ММСК и быстрее восстанавливалась.

Сравнивая эффективность терапии ОПН двумя видами клеток, можно отметить двойственность эффекта ППК. С одной стороны, эти клетки в меньшей степени, чем ММСК улучшали выживаемость животных, а с другой - у выживших крыс они обеспечивали лучшую функциональную сохранность органа и более быстрое восстановление его полноценности.

Образование межклеточных контактов при сокультивировании

В данной работе была подтверждена высокая эффективность различных типов стволовых и прогениторных клеток в восстановлении функций поврежденной почки. Однако, остается невыясненным механизм положительного влияния введения этих клеток. В частности наибольший интерес представляет степень интеграции чужеродных клеток в ткань поврежденного органа и взаимодействия клеток донора и реципиента.

В этой связи была исследована возможность транспорта цитоплазмы, митохондрий и других мембранных структур между ММСК и дифференцированными специализированными клетками: культивируемыми кардиомиоцитами и клетками почечного эпителия. По ряду методических причин первые эксперименты были проведены на кардиомиоцитах. Прежде всего, это связано с возможностью более четкого фенотипирования мышечных клеток сердца по ряду специфических маркеров, в отличие от эпителия канальцев почки.

Рис. 22. Образование туннельных нанотрубочек (ТНТ) при кокультивировании кардиомиоцитов (КМ) и МСК. А - фазовый контраст, Б - окраска митохондрий внутри ТНТ, В - сканирующая электронная микроскопия. Масштаб 20, 50 и 3 мкм, соответственно. Процент клеток, образующих ТНТ (Г)