Автореферат: Митохондрии как центральное звено повреждающих и защитных сигнальных путей при развитии почечной недостаточности

Рис. 5. Влияние LiCl (3 мМ) и инсулина (60 нМ) на продукцию АФК и на величину мембранного потенциала в культивируемых почечных клетках, подвергавшихся действию ишемии/реоксигенации. Представлена средняя интенсивность флуоресценции TMRE и DCF (красный и зеленый столбец соответственно), измеренные на конфокальных изображениях.

Защитные эффекты ингибирования GSK-3 фармакологическими агентами были подтверждены на модели ишемии/реоксигенации культивируемых клеток почечных канальцев. Для этого клетки инкубировали в течение ишемии с LiCl и инсулином в концентрациях 6 мМ и 60 нМ, соответственно. Найдено, что обработка ионами лития приводит к снижению флуоресценции DCF (рис. 5), повышенной после И/Р приблизительно в 2 раза, что означает соответственное снижение уровня генерации АФК. К аналогичному эффекту приводит и инкубация первичной культуры клеток почки с инсулином. Пониженный после ишемии потенциал, наоборот, частично восстанавливался (рис. 5 флуоресценция TMRE). Эти данные говорят о том, что и инсулин и ионы лития препятствуют развитию окислительного стресса в клетках, подвергшихся действию И/Р.

Для доказательства GSK-опосредованного действия исследуемых веществ мы исследовали степень фосфорилирования GSK-3 и ее локализацию в клетках методами иммуноцитохимии и иммуноблоттинга (рис. 6). В необработанных клетках фосфорилированной формы киназы не выявляется, тогда как при обработке LiCl в течение 6 ч и особенно 24 ч наблюдается значительное повышение количества фосфо-GSK-3. Таким образом, при используемом нами времени ишемии 24 ч, ионы лития вызывают значительное фосфорилирование GSK-3.

Рис. 6. Повышение количества P-GSK-3 в клетках почки при инкубации с ионами лития. Инкубация с LiCl (Б) вызывает значительное увеличение содержания P-GSK-3 по сравнению с контрольными клетками (А). Видно, что P-GSK-3 локализуется в основном в митохондриях. В - Иммуноблот клеточных лизатов на P-GSK-3.

Иммуноцитохимическое окрашивание на фосфорилированную форму GSK-3 выявило, что в интактных клетках количество фосфорилированной формы очень мало, тогда как 24-ч инкубация с LiCl вызывает значительное увеличение содержания фосфо-GSK-3 в клетках почки. При этом отмечено, что фосфо-GSK-3 локализуется в основном в митохондриях, хотя уровень фосфорилирования цитоплазматического пула GSK-3 также выше, чем в контроле.

Влияние гипоксического и ишемического прекондиционирования на пост-ишемические изменения в ткани почки

ПК является наиболее эффективным способом защиты, снижающим клеточную гибель, вызываемую И/Р. В живых органах традиционная защита ПК достигается короткими эпизодами ишемии и реперфузии, предваряющими длительную окклюзию артерий. Обработка ионами лития может считаться фармакологическим ПК как в кардиомиоцитах (Juhaszova M. et al, 2004), так и в ткани почки. Мы сравнивали эффекты вызываемого ионами лития фармакологического ПК, ишемического ПК, вызываемого краткими эпизодами ишемизации отдельного органа, и действие гипоксического ПК, вызываемого короткими периодами гипоксии у животного.

Рис. 7.Эффект ПК на функциональное состояние митохондрий в клетках почки. A - мембранный потенциал митохондрий; Б - продукция АФК; В - продукция NO (окрашивание с помощью TMRE, DCF и DAF-2, соответственно). И/Р проведена после ишемического или гипоксического прекондиционирования.

На рис. 7А показано, что митохондриальный мембранный потенциал после И/Р (30% от контроля) частично восстанавливался при ишемическом ПК (до 56%), тогда как гипоксическое ПК сохраняло более высокие значения (78% от контроля). Продукция АФК в почках, подвергнутых ишемическому ПК, была более низкой по сравнению с почками после И/Р. Гипоксическое ПК снижало индуцированную И/Р продукцию АФК приблизительно на 66% от контроля (рис. 7Б).

Гипоксическое ПК также влияло на продукцию NO в клетках канальцев после И/Р. По сравнению с контролем, в срезах почек крыс после коротких эпизодов гипоксии и дальнейшей И/Р регистрировали снижение флуоресценции DAF-2 почти на 50% (рис. 7В).

Детальное исследование механизмов, лежащих в основе гипоксического ПК, выявило ряд взаимосвязанных сигнальных путей, повышающих устойчивость клеток почки к ишемии. Выявлено, что уже через 3 суток гипоксического ПК в почках крыс более чем вдвое повышается количество эритропоэтина (рис. 8). Также обнаружено, что эритропоэтин снижает гибель культивируемых клеток почки, сопровождающуюся освобождением в среду лактатдегидрогеназы (ЛДГ) после ишемии. Через 24 ч после ишемии выявлено увеличение активности ЛДГ в среде приблизительно в 3 раза по сравнению с контролем. В присутствии эритропоэтина эти значения снижались практически до контрольных. Кроме того, при гипоксическом ПК в клетках почки увеличивается количество фосфорилированной митохондриальной GSK-3. Ионы лития и инсулин, индуцирующие фосфорилирование GSK-3, также защищали клетки почки от гибели.

Рис. 8. Увеличение количества эритропоэтина (ЭПО) в почке после гипоксического ПК

При введении эритропоэтина в дозе 100МЕ/кг массы тела животного выявлено выраженное увеличение пула фосфо-GSK-3 в клетках почки. Таким образом, действие гипоксической тренировки реализуется, скорее всего, через каскад сигналов: гипоксия вызывает повышение эритропоэтина в ткани почки, а эритропоэтин индуцирует фосфорилирование GSK-3, как это показано при ПК сердца (Nishihara M. et al., 2006).

Активация апоптотических сигнальных путей при ишемии/реперфузии почки

Рис. 9. Иммуногистохимия корковой зоны почки (A-В). В контроле (А) белок Вах диффузно распределен в цитозоле. После ишемии и 10-мин реперфузии Вах начинает сосредотачиваться в митохондриях (Б). Локализация Вах в митохондриях через 3 ч после И/Р (В) подтверждается колокализацией с цитохромоксидазой (Е). Иммуноблот показывает возрастание количества Вах и уменьшение цитохрома с в митохондриях после И/Р (Г).

При изучении участия апоптотических сигналов в повреждениях почки, обнаружено, что уже через 10 мин реперфузии количество белка Вах в митохондриях возрастает (рис. 9Г) приблизительно на 50%. Количество цитохрома с в тех же образцах митохондрий снижалось после И/Р на 40%. Эти данные указывают на запуск апоптотических сигналов под влиянием окислительного стресса в клетках почки. Транслокация белка Вах может индуцировать открытие митохондриальной поры и участвовать в развитии НП и снижении митохондриального потенциала, показанном в данной работе.

Рис. 10. Доказательство участия NO-синтазы в регуляции активности митохондрий. A -изменения трансмембранного потенциала митохондрий в срезах почки после И/Р (окраска TMRE). Б - эффект субстрата NO-синтазы на дыхание выделенных митохондрий почки. Жирная линия - изменение O₂ в среде инкубации; тонкая линия - изменение скорости дыхания. Стрелками указаны моменты добавления 5 мМ сукцината, 15 нМ CCCP, 300 мкМ CaCl₂ и 5мМ L-аргинина.

Эксперименты по иммуногистохимическому выявлению белка Вах в клетках почки подтвердили перераспределение Вах в клетках, подвергшихся И/Р. В контроле наблюдалось диффузное окрашивание цитоплазмы клеток анти-Вах антителами, тогда как после 40-минутной ишемии и 10-минутной реперфузии наблюдалась компартментализация Вах, а через 3 ч - дальнейшее сосредоточение Вах в митохондриях (рис. 9А-В), что отражает развитие апоптотического процесса во времени.

Эти результаты свидетельствуют о том, что при И/Р в клетках почечных канальцев уже в первые минуты реперфузии индуцируются апоптотические сигнальные пути.

Влияние активности NO-синтазы на функционирование митохондрий почки

Одним из мощных регуляторных эффектов оксида азота является подавление митохондриального дыхания через ингибирование цитохромоксидазы дыхательной цепи (Brown G., 2001). Нами было исследовано влияние эндогенно продуцируемого в митохондриях оксида азота на скорость потребления кислорода дыхательной цепью митохондрий, окисляющих сукцинат. Было показано (рис. 10Б), что при добавлении в суспензию митохондрий ионов Ca2+ и аргинина скорость разобщенного дыхания снижалась приблизительно на 18,5% с 0,750,025 до 0,610,02 мкМ О2/сек. При этом добавление Ca2+ само по себе изменений в скорости дыхания не вызывало. Аналогичные данные получены на срезах почки при исследовании влияния продукции NO на падение ?? после ишемии. В то время как И/Р вызывала значительное уменьшение мембранного потенциала, обработка срезов ингибитором NO-синтазы L-NAME восстанавливала его до 50% от уровня контроля (рис. 10А). То есть падение мембранного потенциала митохондрий в этих условиях может быть результатом увеличенной продукции NO в клетках и, в частности, в митохондриях.

Повреждение митохондрий при миоглобин-индуцированной острой почечной недостаточности

Исследование динамики развития ОПН при рабдомиолизе показало, что в первые 2 сут происходит значительное увеличение активности в крови ферментов, маркеров разрушения ткани: ЛДГ, аланин-аминотрансферазы (АЛТ) (рис. 11А). Основным признаком развития почечной недостаточности служило повышение в крови крыс с рабдомиолизом концентрации продуктов азотистого обмена - мочевины и креатинина (уремия и азотемия), которые достигали своего пика на 1-2 сут (рис. 11В). В более поздние сроки большинство показателей нормализовались, что отражает о восстановление функции почек.

Рис. 11. Развитие почечной недостаточности и повреждение митохондрий почки при миоглобинурии.

Повышение в крови концентрации креатинина и мочевины (А), а также АЛТ и ЛДГ (Б) свидетельствуют о развитии ОПН в первые сутки после рабдомиолиза. Миоглобинемия приводит к накоплению миоглобина в почке (В, иммуноблот гомогената почки) уже в первые часы рабдомиолиза. Повреждение митохондрий выражается в появлении в крови цитохрома с (Г, иммуноблот сыворотки крови) за счет выхода его из митохондрий (Д, иммуноблот выделенных митохондрий почки). Указано время после введения глицерина.

Исследование содержания миоглобина в ткани почек после индукции рабдомиолиза выявило его накопление уже в первые часы после введения глицерина животным (рис. 11В). В контрольной почке миоглобин не определяется, однако уже через 4 ч после индукции рабдомиолиза миоглобин появляется в ткани почки, достигает максимальной концентрации через 9 ч, и перестает обнаруживаться в почках через сутки.

В качестве маркера повреждения митохондрий почки мы использовали выход из них цитохрома с. Выявлено, что количество цитохрома в митохондриях, выделенных из почек на разных сроках рабдомиолиза, уменьшается, причем максимальная потеря цитохрома наблюдается через 4 ч после введения глицерина (рис. 11Д).

Окислительный стресс и дисфункция митохондрий при рабдомиолизе

Были проанализированы основные функциональные характеристики митохондрий, выделенных из почек в различные сроки после индукции рабдомиолиза. Оценивались скорость дыхания, дыхательный контроль митохондрий и уровень в них малонового диальдегида (МДА). Обнаружено, что в первые сутки миоглобинурии происходит нарастание количества МДА в митохондриях, что свидетельствует о перекисном окислении митохондриальных липидов, как очевидном результате окислительного стресса.

Таблица 1. Влияние инкубации с миоглобином на функциональные параметры митохондрий почек крыс: скорость дыхания в состоянии 3, состоянии 4 и дыхательный контроль, и воздействие на эти изменения антиокисданта SkQ1 и хелатора железа ДФО.

Скорость дыхания митохондрий в состоянии 4 в этот же период времени возрастает вплоть до 24 ч после глицерин-индуцированной миоглобинурии. Это свидетельствует о значительном разобщении дыхания митохондрий, то есть нарушении барьерной функции внутренней мембраны. Об этом же свидетельствует достоверное уменьшение дыхательного контроля митохондрий через 4 и 15 ч рабдомиолиза.

Влияние миоглобина на функции митохондрий в системе in vitro

Для более детального анализа возможно опосредованного воздействия миоглобина на митохондрии нами изучалось прямое влияние миоглобина на изолированные митохондрии почки. Данные о нарушении функций митохондрий под действием миоглобина обобщены в таблице 1.

Обнаружено, что через 1 ч инкубации в присутствии миоглобина скорость дыхания митохондрии в состоянии 4 возрастает вдвое по сравнению с контролем, при концентрации миоглобина 100 мкМ, а при концентрации 500 мкМ почти в 3 раза. Соответственно, падает и дыхательный контроль митохондрий инкубированных с миоглобином, то есть происходит значительное разобщение дыхания. Очевидно, нарушение барьерной функции внутренней мембраны митохондрий может происходить из-за окисления ее липидов, в результате чего внутренняя митохондриальная мембрана становится проницаемой для ионов.

Рис. 12. Окислительный стресс и повышение продукции NO в митохондриях, инкубированных с миоглобином in vitro.

Образование МДА (А) и нитрита (В) в митохондриях, инкубированных с миоглобином. Влияние 1 мМ ДФО, 100нМ SkQ1, 5мМ аргинина (Арг) и 5 мМ нитроаргинина (L-NAME).