Мы обнаружили, что в процессе культивирования ММСК человека и кардиомиоцитов крысы оба типа клеток демонстрировали образование множества протяженных межклеточных структур (рис. 22А,Б). Электронная сканирующая микроскопия показала (рис. 22В), что эти структуры могут быть либо натянуты между соседними клетками или располагаться свободно вдоль субстрата. Эти структуры различаются по диаметру и форме. Диаметр некоторых почти одинаков на всем протяжении, за исключением начальной/концевой части, имеющей форму воронки, диаметр других изменяется по всей длине. Учитывая небольшой размер трубочек, для простоты мы назвали их туннельными нанотрубочками (ТНТ), согласно термину, предложенному Rustom (Rustom A. et al., 2004).
Передача цитоплазмы между ММСК человека и кардиомиоцитами крысы.
Для выявления транспорта цитоплазмы и определения направления такого транспорта были проведены две серии экспериментов с окрашиванием клеток флуоресцентным красителем Calcein-AM.
Рис. 23. Транспорт цитоплазматического содержимого из МСК, окрашенных калцеином, в неокрашенные кардиомиоциты. Через 24 ч флуоресценция калцеина наблюдается не только в МСК, но и в контактирующих с ними кардиомиоцитах. Передача калцеина происходит как при щелевых контактах между клетками (Б), так и при контакте посредством нанотрубочек (А). Проточная цитометрия клеток при сокультивировании 3 (В), 24 (Г) часа и 24 часа с вибрацией (Д).
Было обнаружено, что через 4 ч после пересадки окрашенных калцеином ММСК в культуру кардиомиоцитов крысы первые начинали образовывать контакты с кардиомицитами в виде нанотрубочек. Флуоресценция Calcein на этом сроке наблюдалась только в ММСК, то есть передачи цитоплазматического содержимого не происходило. Через 24 ч сокультивирования во многих кардиомиоцитах, контактирующих с ММСК, нагруженных калцеином (с высокой интенсивностью флуоресценцией калцеина в цитоплазме), также наблюдалась зеленая флуоресценция, однако более низкой интенсивности (рис. 23А,Б). Таким образом, происходила передача красителя из цитоплазмы ММСК человека в цитоплазму кардиомиоцитов крысы, что свидетельствует о миграции цитоплазматического содержимого ММСК в цитозоль соседних кардиомиоцитов.
Рис. 24. Обмен митохондриями между МСК (зеленая флуоресценция и кардиомиоцитами (красная флуоресценция). Большинство клеток окрашены только одним красителем (A), но в некоторых кардиомиоцитах есть митохондрии из МСК (Б) Электронная микроскопия выявила похожие на митохондрии структуры в нанотрубочках (В-Ж).
Образование межклеточных контактов и обмен содержимым цитоплазмы между клетками были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. Окрашенные калцеином ММСК пересевали на флаконы с неокрашенными кардиомиоцитами. Было обнаружено, что через 3 ч смешанная культура клеток четко подразделялась на 2 субпопуляции по интенсивности флуоресценции Calcein (рис. 23В). После 24 ч сокультивирования деление клеток на 2 субпопуляции исчезало. В суспензии клеток наблюдалось усредненное распределение флуоресценции по интенсивности (рис. 23Б). Это подтверждает предположение об образовании между сокультивируемыми клетками контактов, по которым часть окрашенного калцеином цитоплазматического содержимого передается в неокрашенные клетки кардиомиоцитов.
Передача цитоплазматического содержимого по туннельным нанотрубочкам была подтверждена опытами, в которых сокультивирование происходило в условиях, препятствующих образованию нанотрубочек. В этих условиях через 24 ч наблюдалось такое же разделение клеток на 2 популяции (рис. 23В), как и в начале сокультивирования, то есть передачи цитоплазматического содержимого не происходило.
Передача митохондрий от ММСК к кардиомиоцитам.
При изучении обмена митохондриями между ММСК человека и кардиомиоцитами крысы мы использовали два митохондриальных красителя: Mitotracker Green FM (зеленая флуоресценция) и Mitotracker Red (красная флуоресценция). ММСК окрашивались красителем Mitotracker Green FM перед сокультивированием и помещались в плашку с кардиомиоцитами, нагруженными красителем Mitotracker Red. Через 3 ч сокультивирования перенос митохондрий не детектировался. Через 24 ч сокультивирования большинство клеток содержали митохондрии, окрашенные либо зеленым, либо красным зондом (рис. 24А). Однако некоторые клетки содержали органеллы с зеленой флуоресценцией среди митохондрий, окрашенных красным красителем (рис. 24Б). Малый процент митохондрий с зеленой флуоресценцией среди митохондрий с красной флуоресценцией явно демонстрирует однонаправленный перенос митохондрий, окрашенных зеленым красителем, из ММСК. Интересно отметить, что в данной смешанной культуре клеток мы никогда не наблюдали ММСК, содержащие митохондрии, окрашенные красителем Mitotracker Red, то есть передача митохондрий от кардиомиоцитов к ММСК не происходит. В то же время, после 24 ч сокультивирования зеленая и красная флуоресценция не солоколизовались, что подчеркивает отсутствие внутри одной клетки слияния митохондрий из разных источников.
Исследования с помощью электронной микроскопии показали, что цитоплазматические выросты частично содержат везикулярные структуры, окруженные двойной мембраной, которые напоминают митохондрии по внешнему виду (рис. 24В,Г). Иногда внутри этих везикул можно распознать структуру крист. Часто в нанотрубочках маленького диаметра (0,1 мкм) мы видели везикулы малых размеров, у которых наличие двойной мембраны не было явным (рис. 24Д,Е). В некоторых нанотрубочках мы обнаружили элементы цитоскелета (рис. 24Ж).
Экспрессия кардиоспецифического ??миозина в ММСК
Одним из важных результатов сокультивирования является обнаруженный синтез кардиоспецифичного ?-миозина в ММСК человека после их контактирования с кардиомиоцитами крысы. Нами были использованы высокоспецифичные антитела к тяжелой цепи человеческого ?-миозина, что исключает возможность окраску крысиного миозина в кардиомиоцитах. Было показано, что через сутки после совместного культивирования ММСК и кардиомиоцитов в ММСК выявляются компартменты, положительно окрашивающиеся на кардиоспецифичный ?-миозин. При окрашивании чистой культуры ММСК подобной окраски на ?-миозин в клетках обнаружено не было. Эти результаты указывают на появление экспрессии сократительных белков в ММСК человека после контакта с кардиомиоцитами крысы и на начало кардиоспецифичной дифференцировки стволовых клеток, в результате которой в ММСК начинает формироваться свой сократительный аппарат.
Транспорт митохондрий и других клеточных компартментов между ММСК и клетками почки
Явления транспорта цитоплазмы и митохондрий, обнаруженные при совместном культивировании кардиомиоцитов и ММСК были проверены и расширены на культуре клеток канальцевого эпителия почки. На модели совместной культуры клеток канальцевого эпителия почки крысы и ММСК человека было подтверждено явление образование множества межклеточных нанотрубочек. Активация их образования происходила именно в условиях сокультивирования, причем они начинали образовываться и у ММСК и у канальцевых клеток.
Рис. 25. Передача между почечными клетками и МСК цитоплазматического (А, Calcein), митохондриального (Б, Mitotracker) и мембранного (В, DiO) красителей исследованная проточной цитометрией по изменению соотношения окрашенной и неокрашенной популяций клеток в совместной культуре.
Обмен цитоплазматическим содержимым был исследован с помощью окраски ММСК зондом Calcein и последующим сокультивированием с почечными клетками крысы. Непосредственно после начала сокультивирования клеток выделяются две популяции: неокрашенные и имеющие высокую интенсивность флуоресценции Calcein (рис. 25А). При анализе клеток через 3, 6, 24 и 48 ч сокультивирования обнаружена тенденция к уменьшению обеих начальных популяций и появлению значительного числа клеток с промежуточными значениями интенсивности флуоресценции калцеина. В условиях, когда непосредственный контакт клеток невозможен (в одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах), даже через 48 ч совместного культивирования клетки по-прежнему четко разделялись на две популяции, значительно различающиеся по интенсивности флуоресценции (рис. 25А).
Обмен митохондриями исследовали аналогичным образом с помощью окраски ММСК флуоресцентным зондом Mitotraсker Green и последующего сокультивирования (рис. 25Б). Уже через 3 ч наблюдался сдвиг средней интенсивности флуоресценции Mitotraсker Green в окрашенной популяции в сторону уменьшения интенсивности флуоресценции. К 24 ч этот сдвиг становился еще более выраженным, одновременно средняя интенсивность флуоресценции популяции клеток почки увеличивалась за счет появления в этих клетках красителя, а к 48 ч сокультивирования пики обеих популяций практически сливались. Можно сделать вывод, что ММСК довольно быстро после образования контактов начинают передавать митохондрии, нагруженные красителем, в клетки почки. При сокультивировании клеток обнаружено некоторое сближение пиков через 48 ч, что указывает на незначительный обмен митохондриальным зондом через культуральную среду, независящий от образования межклеточных контактов.
Наконец, в третьей серии экспериментов была исследована передача между клетками липидного красителя DiO, который накапливается преимущественно в мембранных компартментах клетки, прежде всего в плазмалемме (Honig M.G. and Hume R.I., 1986). Динамика обмена мембранным зондом оказалась схожей с динамикой транспорта калцеина. Уже через 3 ч сокультивирования появлялась популяция клеток со средней интенсивностью флуоресценции, что говорит о начале транспорта красителя из ММСК в эпителиальные клетки (рис. 25В). Через 6 ч доля таких клеток составляла уже 14,5%, а через 24 ч и 48 ч - около 45% всей культуры. Сокультивирование в течение 48 ч в условиях, когда непосредственный контакт клеток невозможен, не привело к значительному изменению средней интенсивности флуоресценции окрашенной и неокрашенной популяций клеток, то есть в данном случае обмена красителем через культуральную среду не происходит.
ВЫВОДЫ
1. При исследовании срезов почки с помощью витальных флуоресцентных зондов показано, что в условиях ишемии/реоксигенации в клетках почки происходит резкое усиление генерации активных форм кислорода и NO, основным источником которых служат митохондрии. При этом происходит нарушение морфо-функционального состояния митохондрий: падение митохондриального трансмембранного потенциала, набухание митохондрий и фрагментация хондриома.
2. При рабдомиолизе развитие почечной недостаточности сопровождается дисфункцией митохондрий почки и развитием окислительного стресса, индуцированного накоплением миоглобина в почечных канальцах. При воздействии in vitro на выделенные митохондрии миоглобин вызывает разобщение окислительного фосфорилирования, возрастание перекисного окисления липидов митохондрий и повышение продукции оксида азота в митохондриях.
3. При ишемии/реоксигенации и при рабдомиолизе в митохондриях клеток почки наблюдаются проапоптотические изменения, такие как выход из митохондрий цитохрома с и транслокация в митохондрии белка Вах. Это свидетельствует об активации в клетках почки апоптотических сигнальных путей под действием ишемии/реоксигенации и миоглобинурии.
4. Ишемическое и гипоксическое прекондиционирование приводит к ингибированию GSK-3, что защищает митохондрии клеток почки от развития неспецифической проницаемости, уменьшает генерацию активных форм кислорода и предотвращает гибель клеток почки. Схожий защитный эффект, опосредованный прямым и непрямым ингибированием GSK-3?, оказывают ионы лития и инсулин, снижая окислительный стресс в почке, гибель клеток и в конечном итоге предотвращая развитие почечной недостаточности.
5. По данным исследований на культивируемых клетках почки и переживающих почечных срезах адресованные в митохондрии антиоксиданты 10-(6'-пластохинонил) децилтрифосфоний (SkQ1) и 10-(6'-пластолхинонил) децил-родамин (SkQR1) снижают вызванное ишемией/реперфузией повреждение, уменьшают окислительный стресс, предотвращают дисфункцию митохондрий и защищают клетки почки от гибели. Защитное действие SkQ1 и SkQR1 проявляется также в защите животных от гибели после 90-минутной ишемии единственной почки
6. Введение ММСК внутривенно или в ткань почки существенно улучшает функции почки при ОПН и ХПН, что выражается в снижении повышенной концентрации креатинина и мочевины в крови, уменьшении патоморфологических изменений в ткани почки и повышает выживание животных.
7. Введение прогениторных почечных клеток оказывает менее выраженный положительный эффект на функции почки при ОПН и ХПН. Введение этих клеток также снижает концентрации креатинина и мочевины в крови, однако, в меньшей степени, чем при введении ММСК. Выживание животных с почечными патологиями при введении прогениторных почечных клеток тоже улучшается незначительно.
8. Выявлено, что ММСК могут образовывать контакты с различными типами дифференцированных клеток при совместном культивировании. При этом между клетками возможен транспорт клеточного содержимого, в том числе митохондрий, на что указывают данные электронной микроскопии и окрашивание специфическими митохондриальными зондами.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Плотников Е.Ю., Фрезе К.В., Коц А.Я., Хропов Ю.В., Овчинников И.В., Махова Н.Н. Ограниченный тепловой шок повышает устойчивость клеток линии HeLa к цитотоксическому действию оксида азота // Тезисы международной конференции студентов и аспирантов “Ломоносов-2001”, М.: 2001, 34-35