Однако, падение дыхательного контроля и разобщение окислительного фосфорилирования, происходящие под действием миоглобина, практически не предотвращаются хелатором ионов железа десфероксамином (ДФО, таб.1). Интересно, что и применение митохондриального антиоксиданта SkQ1 (см. ниже), не влияло на степень сопряженности изолированных митохондрий. В то же время, и ДФО и данный антиоксидант серьезно уменьшали генерацию МДА-продуктов и образование нитрита (см. ниже).
Окислительный стресс и продукция NO в митохондриях, спровоцированные миоглобином
Предположение об окислении липидного бислоя при воздействии миоглобина было подтверждено при измерении накопления МДА в таких митохондриях (рис. 12А). Было выявлено, что количество МДА возрастает при инкубации со 100 мкМ миоглобина в 2 раза, а при 500 мкМ в течение 1 ч утраивается. Интересным оказался эффект ДФО и митохондриального антиоксиданта SkQ1. Так при действии ДФО на фоне инкубации с миоглобином происходило значительное снижение уровня МДА в митохондриях по сравнению с инкубацией только с миоглобином, хотя значения МДА и не достигали уровня контроля. Аналогичным образом проявился эффект SkQ1. Известно, что этот новый митохондриально-адресованный антиоксидант накапливается в митохондриях и эффективно предотвращает продукцию АФК и дисфункцию митохондрий при различных типах окислительного стресса (Скулачев В.П. и др.,2008). В данной модели окислительного стресса SkQ1 также снижал накопление МДА в митохондриях (рис. 12А). Таким образом, важной составляющей повреждающего воздействия миоглобина является высвобождающееся из гема железо, которое, очевидно, вызывает перекисное окисление липидов, инициируемое реакцией Фентона. Предотвращение такого окисления с помощью удаления ионов железа или антиоксиданта значительно снижает накопление МДА, однако не может полностью блокировать открытие неспецифической поры митохондрий (см. выше).
Рис. 13. Падение мембранного потенциала митохондрий (А) и повышение продукции АФК (Б) почечных канальцев после инкубации 1 час с 500 мкМ миоглобина. Конфокальная микроскопия после окраски TMRE и DCF, соответственно. Показана относительная интенсивность флуоресценции красителей.
Наконец, было изучено изменение продукции NO при миоглобин-индуцированном повреждении митохондрий. Предпосылкой для этого послужило обнаруженное нами увеличение концентрации нитрита, продукта окисления NO, в крови крыс, подвергшихся рабдомиолизу. В этом случае концентрация нитрита составляла 12±1,5 мкМ на 2 сутки начала миоглобинурии против 4,5±0,5 мкМ у контрольных крыс.
При воздействии миоглобина in vitro нами также было обнаружено увеличение содержания нитрита в среде инкубации митохондрий (рис. 12В). При инкубации с 500 мкМ миоглобина содержание нитрита возрастало почти в 7 раз по отношению к контролю. Таким образом, мы предположили, что при воздействии миоглобина в митохондриях активируется митохондриальная NO-синтаза, что значительно увеличивает продукцию NO. Это предположение подтвердилось при инкубации митохондрий с субстратом синтеза NO, L-аргинином. При инкубации митохондрий с миоглобином в присутствии 5 мМ аргинина содержание нитрита возросло не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с инкубацией только с миоглобином (рис. 12В). Наоборот, присутствие в среде инкубации ингибитора NO-синтазы, L-нитроаргинина снижало содержание нитрита до контрольных значений. В этих условиях ДФО и антиоксидант SkQ1 также снижали миоглобин-индуцированный рост концентрации нитрита. Можно предполагать, что высвобождаемые из гема миоглобина ионы железа и вызванный ими окислительный стресс вызывают увеличение активности митохондриальной NO-синтазы, поэтому снижение процессов перекисного окисления за счет хелатирования ионов железа или снижения уровня АФК, приводит к соответствующему снижению активации NO-синтазы.
Окислительный стресс и дисфункция митохондрий почечных канальцев, спровоцированные миоглобином
Индукция миоглобином окислительного стресса и дисфункция митохондрий, которые были продемонстрированы на изолированных митохондриях, были подтверждены на модели выделенных почечных канальцев с помощью конфокальной микроскопии. Было показано, что инкубация почечных канальцев с 100 мкМ миоглобина приводила к увеличению флуоресценции DCF в клетках канальцев (рис. 13Б), что свидетельствует о повышении продукции АФК. Одновременно выявлено значительное падение интенсивности флуоресценции TMRE, то есть снижение митохондриального мембранного потенциала (рис. 13А). Эти факты подтверждают сделанные нами выводы о повреждении под действием миоглобина барьерных функций митохондриальной мембраны и о развитии окислительного стресса. Интересно, что одновременное окрашивание канальцев DCF и TMRE выявило колоколизацию этих зондов, что указывает на преимущественную генерацию АФК именно в митохондриях.
Влияние SkQ1, инсулина и ионов лития на гибель при ишемии/реоксигенации
Рис. 14. Защита от апоптотической гибели после ишемии/реоксигенации (И/Р) культивируемых клеток почки. А - действие SkQ1 при 5-дневном культивировании, Б - действие инсулина (120 нМ) и LiCl (3 мМ) непосредственно перед ишемией на выживание клеток почечных канальцев. Внизу: увеличение популяции Аннексин V-положительных клеток при И/Р и предотвращение этого эффекта предобработкой LiCl, инсулина и SkQ1.
На модели И/Р почки были получены свидетельства ведущей роли митохондрий в развитии окислительного стресса и участия в этом процессе неспецифической митохондриальной поры, регулируемой GSK-3. Поэтому, далее были детально исследованы сигнальные пути, ассоциированные с митохондриями и гибелью клеток при ишемии на модели ишемии/реоксигенации культуры клеток почечного эпителия. В первую очередь было исследовано взаимоотношение сигнальных путей фрагментации митохондрий и гибели клетки при ишемии и других проапоптотических стимулах. В качестве защитных агентов использовались ионы лития и инсулин, а также митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1 (Скулачев В.П., 2007).
Рис. 15. Фрагментация митохондрий в клетках почки после И/Р, окрашивание TMRE. В клетках контрольной почки митохондрии сохраняют филаментную структуру, после И/Р происходит фрагментация митохондрий. Инкубация с SkQ1 (120 нМ) или инсулином (120 нМ) защищает от И/Р-индуцированной фрагментации. Масштаб 20 мкм. Диаграмма иллюстрирует изменения среднего размера фрагмента митохондрий при различных условиях.
Было выявлено, что при воздействии на культивируемые клетки почки крыс 24-часовой ишемии с последующей реоксигенацией в течение 24 ч гибель клеток превышала 80% (рис. 14А). При инкубации клеток почки с различными концентрациями SkQ1 в течение 5 сут с последующей 24-часовой ишемией и реоксигенацией в течение 24 ч гибель клеток снижалась. Выявлены достоверные защитные эффекты SkQ1, которые проявлялись при его присутствии в среде в концентрациях 31, 62, 125 и 250 нМ (рис. 14А). При этом концентрация 250 нМ оказывала меньший эффект, чем 125 нМ, а при концентрации SkQ1 500 нМ выживание клеток снижалось, то есть SkQ1 начинал оказывать повреждающий, возможно прооксидантный, эффект в условиях ишемии.
В результате инкубации клеток почки с инсулином и ионами лития мы также наблюдали выраженный защитный эффект на культуру клеток почки, которая находилась в условиях ишемии/реоксигенации. Как видно из рис. 14Б, количество живых клеток после ишемии/реоксигенации увеличилось более чем вдвое при инкубации с 3 мМ LiCl. Аналогичное увеличение устойчивости клеток к И/Р наблюдалось при инкубации в ходе ишемии с 120 нМ инсулина. Таким образом, можно заключить, что и ионы лития, и инсулин, и митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1 являются агентами, защищающими клетки почки от гибели, вызванной И/Р.
Окрашивание культивируемых клеток с помощью Аннексин V-ФИТЦ показало, что спустя 24 ч после ишемии в культуре наблюдается значительное увеличение количества апоптотических клеток по сравнению с контролем (рис. 14, внизу). В случае предобработки клеток ионами лития, инсулином или SkQ1 количество апоптотических клеток после ишемии сокращалось почти вдвое.
Изменение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки после ишемии/реоксигенации
При изучении морфологического состояния митохондрий клеток почки были выявлены значительные изменения структуры митохондрий после ишемии/реоксигенации. Обнаружено, что через 15 мин реоксигенации после 24-часовой ишемии митохондрии клеток оказываются значительно фрагментированы (рис. 15). В это же время в контрольных клетках митохондрии имеют нитевидную структуру с возможными разветвлениями. В клетках, подвергшихся ишемии/реоксигенации митохондриальный аппарат дробится на отдельные мелкие фрагменты. Ранее было известно, что гибель клетки может сопровождаться фрагментацией митохондриальной сети (Parra V. et al., 2008, Brooks C. and Dong Z., 2007).
Мы обнаружили, что обработанные 120 нМ SkQ1 в течение 5 сут клетки после 24-часовой ишемии и 15-минутной реоксигенации содержали нефрагментированные митохондрии (рис. 15). Несмотря на то, что часть клеток в условиях ишемии гибла, в оставшихся клетках морфо-функциональное состояние митохондриального аппарата было близким к норме. Кроме того мы показали, что схожий эффект на структуру митохондриального ретикулума оказывает инкубация с 120 нМ инсулина, когда фрагментация митохондрий после 24-часовой ишемии и 15-минутной реоксигенации также существенно снижалась.
Подсчет клеток с фрагментированными митохондриями показал, что контрольные клетки содержат в основном нефрагментированные митохондриальные филаменты, а после И/Р только около 10-20% клеток сохраняют нитевидную структуру митохондрий, в остальных клетках митохондрии частично или полностью фрагментированы (рис. 15).
Так как фрагментация митохондрий наблюдалась на ранних стадиях после ишемии/реоксигенации, можно заключить, что предотвращение фрагментации митохондрий обеспечивает лучшую выживаемость клеток при данных условиях. То есть фрагментация митохондрий и дальнейшее выживание клеток тесно взаимосвязаны, и такие агенты, как антиоксидант (SkQ1), ингибитор GSK-3 (LiCl) и сигнальная молекула (инсулин) являются одинаково эффективными для защиты как от фрагментации митохондрий, так и индуцированной клеточной гибели.
Влияние митохондриальных антиоксидантов на течение ишемической острой почечной недостаточности
Рис. 16. Генерация АФК в срезах почки, определяемая по флуоресценции DCF. а - контроль, б - почка после 40 мин ишемии с последующей 10 мин реперфузией, в - почка крысы, получавшей 1 мкмоль/кг в день SkQR1 перед ишемией. Шкала 100 мкм. г,д,е - средняя продукция АФК в почке.
В связи с тем, что при И/Р почки было показано развитие окислительного стресса и дисфункции митохондрий, в ряде экспериментов исследовали влияние митохондриальных антиоксидантов, поскольку на модели ишемии/реоксигенации культивируемых почечных клеток эти вещества показали высокую эффективность в предотвращении гиперпродукции АФК и нарушении структуры митохондрий.
После 40 мин почечной ишемии ex vivo с последующей реоксигенацией было найдено, что продукция АФК (определяемая по флуоресценции DCF в срезах почки) значительно возрастает (рис. 16Б, Г-Е). Однократная внутрибрюшинная инъекция животным SkQR1 (1 мкмоль/кг) за сутки до ишемии вызывала частичную нормализацию уровня АФК (рис. 16В,Г). Инъекция того же количества SkQ1 или MitoQ (рис. 16Д,Е) не оказывала статистически значимого эффекта.
При моделировании И/Р почки с одновременным удалением второй почки был обнаружен выраженный антиишемический эффект SkQR1 при введении его в дозе 1 мкмоль/кг за сутки до ишемии. Нормализация функционального состояния почки выражалась в снижении концентрации креатинина в крови, повышенной после И/Р и восстановлении нарушенной реабсорбции Са2+. Эти наблюдения указывают на то, что SkQR1, по крайней мере частично, защищает почечную ткань от повреждения, вызванного И/Р. В то же время, аналогичные дозы SkQ1 не оказывали заметного влияния на уровень креатинина. Положительный эффект наблюдался лишь при увеличении длительности воздействия SkQ1, когда антиоксидант давался крысам с пищей в течение 3 недель в дозе 250 нмоль/кг в сутки.
Рис. 17. Выживание крыс с одной почкой, подвергнутых 90-мин ишемии с последующей реперфузией. Вторая почка удалена. SkQ1 или SkQR1 были инъецированы внутрибрюшинно за сутки до ишемии.
Ишемия единственной почки с последующей реоксигенацией вызывала гибель большинства крыс погибало к 4 сут после операции. В то же время, предварительное введение SkQR1 или SkQ1 почти полностью предотвращало гибель экспериментальных животных (рис. 17). Исследование зависимости выживания крыс от дозы введенного SkQ1 показало, что оптимальными концентрациями являются дозы от 100 нмоль/кг до 1 мкмоль/кг при введении за сутки до ишемии. При снижении концентрации до 5 нмоль/кг или повышении ее до 5 мкмоль/кг выживание крыс значительно снижалось.
Для улучшения понимания процессов, происходящих in vivo в почке при ишемии и реперфузии, были разработаны режимы магнитно-резонансной томографии (МРТ) почки животных (автор выражает признательность директору Центра магнитной томографии и спектроскопии (ЦМТС) МГУ профессору Пирогову Ю.А. за предоставленную возможность проведения исследований)