5. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при введении животным способствуют уменьшению выраженности повреждения почек при острой и хронической почечной недостаточности
6. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки могут при совместном культивировании образовывать контакты с клетками почки и другими дифференцированными клетками. Между контактирующими клетками происходит транспорт клеточного содержимого, в том числе митохондрий.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах отдела биоэнергетики НИИ Физико-Химической биологии им. А.Н.Белозерского. Отдельные аспекты работы представлялись на Международной конференции “Ломоносов”, (Москва, 2001, 2006, 2007, 2008), 5-ой конференции “Биология -- наука 21-го века” (Пущино, 2001, 2007), 6-ой школе Джона Хамфри по иммунологии (Пущино, 2002), конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), 3-ем съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной научной школе «Free radicals and diseases: gene expression, cellular metabolism and pathophysiology» (Греция, 2004), конференции «Российская Биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), европейских биоэнергетических конференциях EBEC (Москва, 2006, Дублин, 2008), конференции FEBS2007 (Вена, 2007), конференции Mitochondrial physiology. MiP2007 64th Harden conference (Австрия, 2007), XI съезде урологов России (Москва, 2007), Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2008).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 64 печатных работах, из них 25 - в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация написана на 325 страницах, состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы включает 34 отечественных и 558 иностранных источника.
Опыты по моделированию ишемии/реперфузии (И/Р) почки проводились на самцах белых беспородных крыс массой тела 180-200 г, содержавшихся в условиях вивария. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ Физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского. Для моделирования И/Р под хлоралгидратным наркозом выделяли и пережимали сосудистую ножку почки сосудистым зажимом на различные периоды времени. После снятия зажимов отсчитывали время реперфузии. После окончания периода реперфузии либо удаляли почку для дальнейших экспериментов, либо накладывали швы и выводили животное из наркоза. Рабдомиолиз вызывали по стандартной методике - введением 50%-ного водного раствора глицерина в мышцы задних конечностей крысы из расчета 10 мл/ кг (Zurovsky Y., 1993).
Митохондрии почек крысы выделяли методом дифференциального центрифугирования. Использовали среду выделения: 0,25 М сахароза, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% БСА, рН7,5. Эксперименты проводили в среде выделения, не содержащей БСА и ЭДТА. Содержание белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты.
Первичную культуру клеток почечных канальцев крыс получали путем диссоциации ткани в 0,1% растворе коллагеназы, клетки осаждали центрифугированием при 400 g. Осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM/F-12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и высаживали на культуральные планшеты или специальные культуральные флаконы с плотностью 1х105 клеток/мл. Клетки культивировали в инкубаторе с влажной атмосферой и концентрацией СО2 5% в течение 1-2 дней, после чего использовали для проведения экспериментов. Ишемию моделировали в растворе Хенкса, насыщенном газообразным азотом для создания аноксических условий. Клетки инкубировали в аноксичных условиях в течение 24 ч при 37оС.
Митохондриальный трансмембранный потенциал оценивали при помощи этилового эфира тетраметилродамина (TMRE, Invitrogen, США). Образование АФК детектировалось с помощью 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF, Invitrogen, США). Образование оксида азота исследовали с помощью 4,5-диаминофлуоресцеина (DAF-2 DA, Invitrogen, США).
Культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и прогениторных клеток почки (ППК), полученные из аутопсийного материала плодов 8-12 недель гестации, были предоставлены НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им.В.И.Кулакова. Фенотип ММСК был подтвержден позитивной окраской на маркеры CD90 и CD105, и отрицательной на маркеры CD34, CD45.
Рис. 1. Мембранный потенциал митохондрий в клетках почки крысы, окраска TMRE.
A - срезы контрольной почки и почки после И/Р. Б - митохондрии в клетках контрольной почки и почки после И/Р при большом увеличении. В - оценка митохондриального трансмембранного потенциала; действие 1 мк M циклоспорина А (CsA). Г - Электронные микрофотографии контрольной почки и почки после И/Р демонстрируют набухание митохондрий в клетках почки после И/Р. Шкала 100 мкм (A), 10 мкм (Б), 1 мкм (Г).
Для оценки транспорта цитоплазматического содержимого клетки окрашивались 2,5 мкМ Calcein AM (Invitrogen, США). Для оценки транспорта митохондрий клетки окрашивались 1 мкМ Mitotracker Green FM или Mitotracker Red (Invitrogen, США). Для оценки транспорта липидов мембран клетки окрашивались 2,5 мкМ DiO, DiD или DiL (Vybrant, Invitrogen, США). Микроскопическое изучение клеток почки производилось на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Изображение обрабатывалось программным пакетом ImageJ. Проточная цитофлуориметрия проводилась с помощью проточного цитометра CyFlow (Partec GmbH, Германия).
Изменение структуры и функций митохондрий клеток витальных срезов почки после ишемии/реперфузии
В данной работе разработана методика изучения функционального состояния клеток ткани в витальных срезах коры почки. Данные, полученные при окрашивании срезов почки красителем TMRE, свидетельствуют о значительном падении в митохондриях почки после прекращения кровотока на 40 мин и последующей реперфузии, когда относительная интенсивность флуоресценции TMRE снизилась на 60% по сравнению с контрольной почкой (рис. 1А). Такое снижение может быть вызвано в частности индукцией в митохондриях неспецифической проницаемости (НП) внутренней мембраны (митохондриальной поры). В результате воздействия циклоспорина А на срезы почки после И/Р доля высоко энергизованных митохондрий увеличилась на 18% по сравнению с необработанными срезами, что указывает на открытие митохондриальной поры (рис. 1В).
Изучение морфологического состояния митохондрий показало значительные изменения структуры митохондрий после И/Р (рис. 1Б).
Рис. 2. Генерация АФК в срезах почки крысы. А-В, Д - окрашивание DCF, Г, Д - окрашивание TMRE. A - контрольная почка, Б - почка после И/Р. В-Д - большое увеличение зоны из рисунка Б. Д,Е - колоколизация АФК и митохондриального красителя. Шкала100 мкм (А, Б) и 10 мкм (В-Д).
Митохондрии контрольной почки имели палочковидную или нитевидную структуру, характерную для митохондрий большинства клеток в норме. В то же время в опытных образцах митохондрии сильно увеличивались в объеме, заполняя практически всю цитоплазму (рис. 1Б). Помимо набухания часто И/Р вызывала фрагментацию единой митохондриальной сети на мелкие частицы, обладающие мембранным потенциалом (рис. 1Б). Таким образом, данные конфокальной микроскопии клеток почки позволяют предположить, что при И/Р почки происходит индукция НП и подавление функций митохондрий, приводящее к их набуханию, а крайнем варианте и фрагментации.
Электронная микроскопия также выявила значительное набухание митохондрий клетках почек, подвергшихся И/Р. По сравнению с нормальной ультраструктурой митохондрий в контрольной почке, после ишемии митохондрии имели увеличенный объем матрикса, часто становились плохо различимыми структуры крист (рис. 1Г).
Повышение продукции АФК в клетках витальных срезов почки
После И/Р в клетках почечной ткани образовывалось вдвое больше АФК чем в контрольной почке (рис. 2А,Б). Это указывает на развитие окислительного стресса в клетках, подвергшихся И/Р, и может объяснять фрагментацию митохондрий, поскольку основным ее индуктором, как сказано выше, являются АФК. Воздействие ионов лития в пред-ишемический период приводило к значительному снижению флуоресценции DCF в клетках после И/Р, то есть уменьшало выраженность генерации АФК и окислительного стресса. Повышенная продукция кислородных радикалов (интенсивность флуоресценции DCF) находится в обратной зависимости от величины потенциала митохондрий (интенсивность флуоресценции TMRE).
Рис. 3. Продукция NO в срезах почки крысы. A - продукция NO выше в клетках почки после И/Р. Ингибитор NO-синтазы L-NAME (5 мМ) снижает количество NO. митохондрия клетка почка ишемия
Локализация генерации АФК определялась методом двойного окрашивания клеток почки TMRE и DCF. Была обнаружена практически полная колокализация изображения митохондрий, окрашенных TMRE, и структур, окрашенных на АФК (рис. 2Г-Е). Это свидетельствует о том, что продукция АФК происходит преимущественно в митохондриях.
Инъекция LiCl перед И/Р не влияет на увеличение количества NO. Б-Г - клетки канальцев почек крысы после И/Р, окрашивание DAF-2 (Б) и TMRE (В). Масштаб 10 мкм. Г,Е - колоколизация NO и митохондриального красителя.
Таким образом, полностью подтвердилась гипотеза о митохондриальном происхождении АФК, образующихся в ходе И/Р в клетках почки.
Повышение продукции NO в клетках почки.
Исследование концентрации нитрита в ткани почки показало, что генерация продукции нитрита начинается уже в ходе ишемии, достигает максимума (5,5 мг/г ткани почки) на 10 мин реперфузии и снижается до 3,8 мг/г ткани почки после 1 ч реперфузии. Основная активация образования нитрита приходится на первые минуты реперфузии, очевидно именно в это время происходит максимальная функциональная активация синтеза NO.
Для более детального исследования генерации NO в клетках почки при И/Р было использовано окрашивание витальных срезов почки DAF-2 DA, который является специфическим флуоресцирующим зондом на оксид азота (Nagano T. and Yoshimura T., 2002). По относительной интенсивности флуоресценции DАF-2 можно судить о продукции NO в клетке. В клетках контрольных почек средняя интенсивность флуоресценция DАF-2 составляла 9,50,5 отн.ед., то есть продукция NO находилась на низком уровне (рис. 3А И/Р почки вызывала возрастание продукции NO до 33,0±0,8 отн.ед., что коррелирует с данными образования нитрита в почке, причем эта генерация обусловлена именно активностью NO-синтазы, поскольку специфически подавляется ингибитором NOS, L-NAME (рис. 3А).
Интересно, что предварительное введение крысам ионов лития очень слабо влияло на продукцию NO после И/Р (рис. 3А). По-видимому, активация NO-синтаз в клетках при И/Р не является следствием открытия митохондриальной поры.
Рис. 4. Роль GSK-3в в защите почки. A - мембранный потенциал митохондрий, Б - продукция АФК в клетках почки после введения животным LiCl перед ишемией.
В - изменения фосфорилированной формы GSK-3в (P-GSK-3в), и Г - тотальной GSK-3в в выделенных митохондриях почки после введения Li+. Д - трансмембранный потенциал выделенных митохондрий контрольной почки, почки после И/Р и почки после И/Р с предобработкой Li
Было проведено исследование локализации генерации оксида азота методом двойного окрашивания клеток почки TMRE и DАF-2-DA. Анализ изображений показал совпадение локализации окраски на митохондриальный мембранный потенциал и на NO (рис. 3Б-Д). Таким образом, большая часть продукции NO в анализируемых клетках приходится на митохондрии.
Защитный эффект ионов лития и роль GSK-3. при повреждении, вызванном ишемией/реперфузией
Как показано для кардиомиоцитов, ключевую роль в процессе ишемического прекондиционирования (ПК) играет GSK-3? (Juhaszova M. et al., 2004), на которой сходятся многие пути защитной сигнализации. Защитный эффект Li+ объясняется тем, что ионы лития блокируют активность GSK-3, и это делает его перспективным антиишемическим агентом для любых тканей, подвергающихся И/Р.
После внутрибрюшинной инъекции LiCl (50 мг/кг) перед ишемией почки, деполяризация митохондриальных мембран в клетках канальцев, вызываемая И/Р, значительно снижалась (рис. 4А). Учитывая чувствительность индуцированной потери потенциала ????к циклоспорину А, мы предположили, что защитный эффект введения Li+ достигался через снижение возможности индукции НП, как это имело место в случае кардиомиоцитов (Juhaszova M. et al., 2004). Так как индукция НП в кардиомиоцитах сопровождалась окислительным взрывом (ROS-induced-ROS-release; Zorov D.B. et al., 2000), то защита от индукции НП снижает избыточную продукцию АФК в клетках. На это указывает то, что обработка Li+ перед ишемией почки приводила к значительному снижению флуоресценции DCF, и следовательно, к меньшему окислительному стрессу после И/Р (рис. 4Б). Такая же тенденция наблюдается на митохондриях, выделенных из почки, подвергнутой И/Р (рис. 4Д). В таких митохондриях значение ??? было существенно ниже нормы и значительно восстанавливалось при предобработке почки Li+. Прямым доказательством того, что действие ионов лития направлено на активность GSK-3??в клетках почки, является тот факт, что инъекция LiCl приводила к накоплению фосфорилированной формы GSK-3? (рис. 4В), для которой известно, что она неактивна (Sutherland C. et al., 1993).
Изучение влияния ионов лития на функциональное состояние ишемизированной почки у животных in vivo показало, что введение хлорида лития в дозе 10 мг за час до 60-минутной ишемии значительно улучшало функциональные параметры почки, наблюдаемые после ишемии. Выявлено, что показатели эндогенного креатинина крови после перенесенной ишемии составляли более 140 мкМ по сравнению с 40 мкМ в контроле, что свидетельствует о неспособности почек удалять продукты азотистого обмена из крови. На фоне предварительного введения хлорида лития уровень креатинина снижался до 60 мкМ. Клиренс креатинина, снижавшийся после ишемии, на фоне предварительного введения лития оставался в пределах нормы. Концентрация мочевины крови, также значительно повышенная после перенесенной ишемии, на фоне введения LiCl на 3 сут снижалась до нормы.