Поскольку микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду, это определяет и различия в способах их культивирования.
Культивирование аэробных микроорганизмов проводят на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха либо в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование.
Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве.
Физические методы основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.
В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10--15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла.
В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта - Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.
Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по способу Виньяль - Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3--6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль - Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.
Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.
Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия.
Биологические методы основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, на другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов. В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.
8. Микробиологическая диагностика газовой гангрены
При диагностики газовой гангрены материалом для исследования служат кусочки пораженных тканей (некротизированная и пограничные с ней участки) и отечная жидкость. Кроме того, исследованию в случае необходимости подвергают перевязочный и шовный материал (шелк, кетгут), одежду, образцы почвы; при пищевых интоксикациях, вызванных клостридиями, - испражнения и продукты. Микробиологическая диагностика заключается в выделении из исследуемого материала возбудителя и его идентификации, основанной на изучении морфологических, культуральных, биохимических свойств и определении токсигенности.
Исследования проводят бактериоскопически, бактериологически, путем заражения белых мышей, и серологически.
Бактериоскопически при окраске по грамму учитывают грамположительные палочки, имеющие характерные споры и капсулы.
Бактериологическое исследование заключается в выделении чистой культуры и ее идентификации. Материал для посева предварительно измельчают и гомогенизируют. Кровь центрифугируют и используют осадок. Посев производят на плотные и жидкие среды.
Плотными являются кровяной агар Цейсслера, кровяной агар с бензидином, среда Вильсона - Блера в длинных стеклянных трубочках (С. perfringens в такой среде уже через 3 - 4 ч вызывает почернение в месте своего размножения за счет образования сернистого железа и бурное газообразование за счет ферментации глюкозы).
Жидкие среды: Китта-Тароцци (казеиновые или мясные, содержащие 1 % глюкозы и кусочки печени, перед посевом кипятят и заливают вазелиновым маслом для создания анаэробных условий), молоко. После внесения исследуемого материала пробирки прогревают. Затем фильтраты культур изучают на наличие в них токсинов: к центрифугатам добавляют антитоксические сыворотки основных возбудителей, после чего заражают белых мышей илм морских свинок.
9. Лабораторная диагностика сальмонеллезных инфекций. Лечение и профилактика
Для лабораторной диагностики бактерионосительства при брюшном тифе и паратифах в первые дни болезни и весь лихорадочный период высевают кровь для выделения гемокультуры. В начале второй недели в целях обнаружения агглютининов ставят серологическую реакцию Видаля. В конце второй недели и позже из испражнений и мочи пытаются выделить копро-и уринокультуру сальмонелл.
Для выделения гемокультуры из локтевой вены больного получают 5-10 мл крови, засевают ее в соотношении 1:10 в 10% желчный бульон. Посевы помещают в термостат на 18-24 ч. Выросшую культуру микроскопируют и пересевают на среду Эндо, которую снова на сутки помещают в термостат. Выросшие на ней бесцветные колонии микроскопируют и агглютинируют в адсорбированных специфических анти-О-сыворотках на предметных стеклах. Агтлютинируемые колонии пересевают на скошенный агар и, получив на нем спустя 18-24 ч чистую культуру, пересевают ее на ряд Гисса и, главное, ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках, которая позволит окончательно установить видовую принадлежность. Клинический диагноз тифопаратифов в практике чаще всего подтверждают с помощью реакции Видаля.
Для постановки реакции Видаля берут 2-3 мл крови из локтевой вены или 1 мл из пальца, мочки уха и получают из нее сыворотку, которую последовательно разводят в трех параллельных рядах пробирок от 1:100 до 1:1600 и вносят О-диагностикумы (убитые тифопаратифозные бактерии): в пробирки первого ряда - брюшнотифозный, второго - паратифозный А и третьего - паратифозный В. О-антитела к ним в диагностическом титре 1:200 появляются на второй неделе от момента заболевания. Для исключения О-антител, которые могут оставаться у вакцинированных, реакцию Видаля рекомендуют ставить в динамике. У больных через 3-4 дня титр реакции нарастает, у привитых - остается прежним.
Если сыворотка крови больного агглютинирует одновременно два или три вида диагностикумов, следует учитывать титр агглютинации. При этом специфическая агглютинация происходит в больших, а групповая - в меньших разведениях сыворотки.
Исследование испражнений и мочи обычно начинают со второй-третьей недели заболевания, так как к этому времени брюшнотифозные и паратифозные сальмонеллы поступают с желчью в кишечник, а далее в почки. Берут их в стерильные пробирки или баночки. Высевают на среды Плоскирева. Выделение и идентификацию копро- и уринокультуры, как и гемокультуры, проводят поэтапно. Иногда из дуоденального содержимого выделяют биликультуру.
Выздоровевших выписывают из больницы после двукратных отрицательных бактериологических исследований их испражнений.
Основным препаратом терапии тифо-паратифозных заболеваний является левомицетин. Применяется также ампициллин, рифампицилин, бактрим.
Профилактика сводится в первую очередь, к общесанитарным мероприятиям: улучшению качества водоснабжения, санитарной очистки канализаций и др. Очень важны ранняя диагностика заболевания, выявление бактерионосителей.
Для специфической профилактики применяют химическую сорбированную брюшнотифозную моновакцину
Для диагностики сальмонелл, как возбудителей пищевых токсикоинфекций у больного исследуют рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, а также кровь, при выявлении микробоносителей - испражнения, получаемые после приема слабительного. Для определения факторов и путей передачи сальмонеллезов исследуются остатки пищи, соскобы со столов, разделочных досок, смывы с рук обслуживающего персонала.
Исследуемый материал перед посевом на питательные среды растирают в фарфоровых ступках и взвешивают в изотоническом растворе натрия хлорида.
Основным методом лабораторной диагностики являются выделение чистой культуры сальмонелл и ее идентификация.
При бактериологическом исследовании культуру сальмонелл из различных материалов выделяют, засевая их в чашки Петри со средой Плоскирева. Кровь для получения гемокультуры высевают в желчный бульон. Посевы помещают в термостат. Через 10-12 ч бульонную культуру пересевают на среду Плоскирева. Выросшие на ней бесцветные колонии пересевают на скошенный агар. На третьи сутки полученную культуру пересевают на ряд Гисса и ставят реакцию агглютинации в адсорбированных сыворотках для установления вида. На четвертые сутки определяют биохимические свойства сальмонелл на средах Гисса.
И наконец, для дифференциации сальмонелл, вызывающих сальмонеллезы, от возбудителя паратифа В, который обладает почти одинаковым спектром ферментов, прибегают к биологическому эксперименту, заражая per os белых мышей взвесью культуры. Возбудители сальмонеллезов вызывают у них сепсис, от которого животные погибают через 1-2 суток. Сальмонелла паратифа В для мышей не патогенна.
У больных с гастроинтестинальной формой болезни основным методом лечения является патогенетическая терапия, включающая мероприятия, направленные на дезинтоксикацию и восстановление водно-электролитного баланса и гемодинамики. При генерализованных формах сальмонеллеза наряду с патогенетической терапией необходимо применение антибактериальных средств (левомицетин, ампициллин).
Профилактика сводится к контролю за убоем животных, транспортировкой и хранением мясных, молочных и других продуктов, госпитализации, тщательном обследовании и лечении больных с пищевыми токсикоинфекциями. Специфических методов профилактики нет.
10. Гепатит С: методы лабораторной диагностики, профилактика и терапия
Вирус гепатита С - РНК-содержащий вирус. Таксономическое положение его в настоящее время точно не определено; он близок к семейству флавивирусов.
Представляет собой сферическую частицу, состоящую из нуклеокапсида, окруженного белково-липидной оболочкой. Размер вириона - 80 нм. РНК имеет зоны, кодирующие синтез структурных и неструктурных белков вируса.
Вирус гепатита С характеризуется антигенной изменчивостью, имеются семь основных вариантов вируса.
Резервуар возбудителя гепатита С - инфицированный человек. Основной путь передачи вируса гепатита С - парентеральный. Основное отличие от эпидемиологии вируса гепатита В - более низкая способность вируса гепатита С к передаче от беременной к плоду и при половых контактах.
Характерны преобладание безжелтушных форм и частый переход в хроническую форму заболевания. Вирус является одним из факторов развития первичной гепатоцеллюлярной карциномы.
Генетическая неоднородность, большая изменчивость и внепеченочная репликация HCV в недоступных для иммунного надзора местах (лимфатические узлы, селезенка, моноциты) способствуют длительной персистенции вируса в организме, что является главной причиной высокой частоты перехода острого вирусного гепатита C в хронические формы. Механизмы неэффективной элиминации вируса изучены недостаточно; основное значение придается его изменчивости.